Name: 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 클론 역학과 운명 전이를 모니터링하기 위한 생세포 영상 및 단세포 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 배우세요 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 공초점 생세포 영상과 단세포 추적을 이용한 클론 역학 및 운명 전이 모니터링 방법을. 이 프로토콜은 상피 생물학과 질병 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>with climate control for temperature and CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>far-red live-cell nuclear dye</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>far-red live-cell DNA dye</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;custom order</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>homemade</td><td></td><td>The production of Wnt3A conditioned medium can be found here:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 클론 역학과 운명 전이를 모니터링하기 위한 생세포 영상 및 단세포 추적

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

우리의 연구는 개별 세포가 자기 재생 능력을 갖춘 장 상피 내에서 어떻게 운명을 결정하고 행동을 조율하는지 연구하는 데 중점을 둡니다. 광학 현미경으로는 보편적인 마커(예를 들어, 세포의 막 구획이나 세포 골격)를 분해하여 그것이 실제로 하나의 세포에 속하는지 또는 이웃 세포에 속하는지 판별할 수 없습니다. 하지만 모자이크 오가노이드를 통해 이러한 한계를 실제로 극복할 수 있습니다.먼저, 필요한 시약과 검증된 마우스 및 인간 형광 리포터 장 오가노이드 라인을 준비합니다. 모자이크 오가노이드 생성 3일 전에 두 오가노이드 라인을 Wnt-conditioned medium에 계대 배양하여 줄기세포 확장을 촉진하고 해리 과정 중 세포 생존율을 극대화합니다. DMEM에 5% BME를 준비합니다. 48-well 플레이트의 각 웰에 준비된 BME 20 µL를 코팅하여 세포 부착을 위한 얇은 접착층을 형성한 후, 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 base medium을 첨가하여 BME를 용해시킵니다. 각 라인의 오가노이드를 4 °C에서 300 g로 5분간 원심분리하여 각각 수집합니다. 37 °C 워터배스의 효소 세포 분리 용액에서 5~7분간 배양하여 오가노이드를 단일 세포로 해리합니다. P1000 피펫을 사용하여 현탁액을 반복적으로 피펫팅하여 기계적 해리를 돕습니다. 명시야 현미경으로 해리 상태를 관찰합니다. 주로 단일 세포 또는 2~10개의 세포로 구성된 작은 오가노이드 조각이 보이면 과량의 얼음처럼 차가운 base medium을 첨가하여 반응을 중지시킵니다. 그 후 4 °C에서 300 g로 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. trypan blue 배제법을 사용하여 세포 생존율을 평가하고 생존 세포 수를 측정합니다. 두 세포 집단을 원하는 비율로 혼합하여, 마우스 모자이크 오가노이드의 경우 10 µM Y-27632 dihydrochloride가 보충된 Wnt-conditioned medium 500 µL에, 인간 모자이크 오가노이드 배양의 경우 인간 확장 배지에 총 300,000개의 세포가 되도록 합니다. 부드럽게 피펫팅하여 충분히 섞습니다. 그런 다음 48-well 플레이트에서 코팅 배지를 제거하고 코팅된 웰에 세포 현탁액을 분주합니다. 실온에서 200 g로 5분간 원심분리하고 37 °C에서 배양합니다. P200 피펫 팁을 구부려 준비합니다. 24시간 후, 구부러진 피펫 팁으로 긁어내어 세포층을 기계적으로 분리한 다음, 얼음처럼 차가운 base medium으로 충분히 세척합니다. 추가적인 기계적 전단 없이 4 °C에서 300 g로 3분간 원심분리하여 분리된 응집체를 수집합니다. 응집체를 BME에 재현탁하여 이미징 호환 샘플 캐리어에 플레이팅합니다. 플레이팅된 응집체를 마우스의 경우 ENR medium에서, 인간 모자이크 오가노이드의 경우 인간 확장 배지에서 배양합니다.고개구수 공초점 렌즈와의 광학적 호환성을 보장하기 위해 유리 바닥 이미징 챔버를 사용하십시오. 오가노이드-BME 현탁액을 유리 바닥 중앙 근처에 얇은 돔 형태로 도포하십시오. 오가노이드가 중력에 의해 유리 바닥 쪽으로 가라앉을 수 있도록 플레이트를 4 °C에서 5~10분 동안 배양하십시오. 플레이트를 37 °C로 옮겨 BME가 20~30분 동안 응고되도록 하십시오. 각 웰에 미리 데워둔 성장 배지 500 µL를 추가하십시오. 실시간 이미징을 시작하기 전, 오가노이드가 회복되고 형태가 잡힐 수 있도록 최소 24시간 동안 유지하십시오. 장기 타임랩스 이미지를 획득하고 하위 분석을 위해 단일 세포 추적 및 계통 재구성을 수행하십시오.성공적인 모자이크 형성은 사용된 해리 정도에 따라 소금-후추(salt-and-pepper) 형태의 분포 또는 두 세포 집단 간의 명확한 경계로 나타났다. 철저한 단일 세포 해리는 소금-후추 모자이크를 형성했고, 완만한 분절화는 작은 클론성 클러스터를 유지시켰다. 특정 리포터를 공동 발현하는 개별 세포가 라벨링되지 않은 주변 세포들에 둘러싸여 있을 때, 이동, 분열 또는 압출 과정 중의 세포골격 역학을 해당 세포의 특성으로 명확하게 귀속시킬 수 있다. 핵 H2B 리포터는 모자이크 내에서 유용한 세포 군집의 식별을 용이하게 했으며, 추적 데이터로부터 개별 세포의 수명 분열률 및 리포터 강도 역학과 같은 세포별 측정값을 추출하였다. 술잔세포는 이미징 기간 전반에 걸쳐 높은 MUC2-mNeonGreen 발현을 활성화하고 유지한 반면, 파네스 세포는 초기에 MUC2-mNeonGreen이 활성화된 후 점진적으로 신호가 감소하고 이어서 DEFA5-dsRed가 활성화되는 양상을 보였다. 단일 세포 정량 분석을 통해 개별 세포 수준에서 이러한 순차적 전환이 확인되었다. 추적된 여러 세포의 평균 강도 곡선을 통해 이러한 패턴이 집단 수준에서도 일관됨이 확인되었으며, 파네스 세포 전구체는 MUC2-mNeonGreen과 DEFA5-dsRed 신호 사이에 특징적인 역관계가 나타났다.이 프로토콜을 통해 연구자는 세포 분열, 이동, 또는 온전한 조직 내에서의 압출과 같은 과정 동안 개별 세포가 세포골격을 어떻게 재구성하는지 연구할 수 있습니다. 중요한 고려 사항은 라벨링 비율을 선택하는 것입니다. 희소하게 라벨링된 리포터 세포는 단일 세포 신호를 분리하여 보여주는 반면, 라벨링되지 않은 희소 세포들은 주변 세포들의 반응을 드러내기 때문입니다. 향후 연구에서는 하나의 오가노이드 내에서 운명 리포터와 모자이크 라벨링을 결합하여, 단일 세포의 세포골격 역동성과 운명 결정 사이의 연관성을 밝힐 수 있습니다.

live-cell-imaging-single-cell-tracking-to-monitor-clonal-dynamics

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 배양을 위한 프로토콜, 형광 표지된 미세소관 성장 마커의 일시적 형질주입, 생세포 이미징 및 간기 미세소관 성장 역학의 자동 분석에 대해 자세히 설명합니다.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

배우세요 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 공초점 생세포 영상과 단세포 추적을 이용한 클론 역학 및 운명 전이 모니터링 방법을. 이 프로토콜은 상피 생물학과 질병 메커니즘 연구에 활용됩니다.

인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 클론 역학과 운명 전이를 모니터링하기 위한 생세포 영상 및 단세포 추적

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