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<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
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	<li>Kathe NC, Novakovic M, Allain FHT. Buffer choice and pH strongly influence phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid with RNA. Mol Biol Cell. 2024;35(5):ar73.</li>
	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
	<li>Novakovic M, et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat Commun. 2025;16(1):4628.</li>
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</ol>

```html
<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>브랜드는 상관 없음</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18웰 챔버 슬라이드</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>STORM용</td></tr><tr><td>아가로스, 저 젤링 온도</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>아가로스, 초순수</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>채널 슬라이드</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>현미경용</td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-염료, NHS 화학</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>단백질 표지용</td></tr><tr><td>D2O (중수)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM 버퍼</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD 단백질</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)에 설명된 대로 우리 연구실에서 재조합 발현됨</td></tr><tr><td>가열 블록 또는 수조</td><td>브랜드는 상관 없음</td><td>N/A</td><td>어떤 제조사나 모델이든 무방</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NMR 분광계</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, PATXI 상온 프로브, 더 많은 세부 사항은 ref 13을 참조하세요 (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>NMR 튜브</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, 유리</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 및 P1000 파이펫</td><td>브랜드는 상관 없음</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-염료</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>RNA 표지용</td></tr><tr><td>poly(A) RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>우리 연구실에서 자체 제작된 체외 전사, 길이 약 50 뉴클레오티드, Kathe et al. Mol Biol Cell 2024에 설명됨</td></tr><tr><td>s2m RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>우리 연구실에서 자체 제작된 체외 전사, 길이 45 뉴클레오티드, 시퀀스: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', Kathe et al. Mol Biol Cell 2024에 설명됨</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 핵심 단백질</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kathe et al. Mol Biol Cell 2024에 설명된 대로 우리 연구실에서 재조합 발현됨</td></tr><tr><td>플로팅 소프트웨어(예: R)</td><td>R-Project</td><td>버전 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>STORM 현미경</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ThunderSTORM 플러그인</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>사용된 파이펫의 팁</td><td>브랜드는 상관 없음</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>버전 3.2 및 4.1</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>
```

저융 아가로스 하이드로겔에서의 단백질 안정화 및 단백질—rna 응축액 정량 생물물리학적 측정

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

저융 아가로스 하이드로겔에서의 단백질 안정화 및 단백질—RNA 응축액 정량 생물물리학적 측정

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

따라서 본 연구는 생체분자 응축물(biomolecular condensates)의 동적 특성을 유지하면서 이를 3차원으로 고정하기 위한 표준화된 아가로스 임베딩 프로토콜을 개발하는 데 중점을 두었습니다. 응축물은 이동하거나, 서로 융합되거나, 표면에 달라붙는 경향이 있어 특정 측정에 어려움이 있는데, 본 아가로스 임베딩 프로토콜은 이러한 한계점을 해결합니다.먼저, 적절한 양의 저융점 또는 일반 아가로스를 측정하여 droplet buffer가 담긴 1.5ml 튜브에 넣습니다. 가열 블록이나 항온수조에서 아가로스 스톡을 80~90°C로 가열하고, 약 10분 동안 볼텍싱하여 아가로스를 완전히 용해시킵니다. 가열 블록이나 항온수조에서 저융점 아가로스는 37°C로, 일반 아가로스는 55°C로 아가로스 스톡을 평형화합니다.해당 온도에서 용액이 투명한 액체 상태를 유지하는지 확인하십시오. 온도계를 사용하여 아가로스 스톡의 온도를 확인하십시오. 아가로스와 직접 접촉할 모든 재료를 가열 블록이나 인큐베이터에 2~3분 동안 두어 약 37 °C로 예열하십시오.드롭렛 버퍼, 상 분리 성분 및 샘플용 추가 첨가제를 준비하는 데 필요한 시약을 모으십시오. 준비된 모든 용액을 실온으로 평형화하십시오. 샘플에 필요한 드롭렛 버퍼, 아가로스 스톡, 상 분리 성분 및 보조 첨가제의 필요 부피를 계산하십시오.표준 생물물리학적 분석을 위한 초기값으로 최종 agarose 농도를 0.3에서 0.5% weight per volume로 설정하십시오. 장기 안정화 실험의 경우에는 0.8에서 1.0% weight per volume를 사용하십시오. 미리 가온된 1.5 milliliter 튜브에 계산된 부피의 buffer와 agarose를 먼저 넣은 후, 첨가제와 상 분리 성분을 순서대로 추가하십시오.튜브를 가열 블록이나 항온 수조에 둔 상태에서 공기 방울이 생기지 않도록 혼합물을 몇 번 피펫팅합니다. 피펫을 사용하여 샘플을 현미경 슬라이드 위에 빠르게 옮깁니다. 샘플을 실온에서 5분에서 10분 동안 겔화시킨 후, 표준 현미경 관찰 프로토콜에 따라 샘플을 측정합니다.0.5% w/v 저융점 아가로스(low melting agarose) 존재 하에 N 단백질과 poly-A로 형성된 액적은 상온에서 5분 후, 저융점 아가로스 없이 형성된 액적과 거의 동일한 크기였습니다. 시료 준비 60분 후, 아가로스에 내장된 액적은 크기 변화가 없었으나, 저융점 아가로스가 없는 응축물은 융합 및 표면 젖음 현상으로 인해 크기가 급격히 증가했습니다. 광퇴색 후 형광 회복(FRAP)과 겉보기 액적 확산은 저융점 아가로스가 있을 때와 없을 때 매우 유사했습니다.따라서 이 프로토콜을 통해 연구자들은 액적의 동적 행동을 유지하면서 긴 시간 범위에 걸쳐 액적을 이미징하고 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 가장 어려운 점은 아가로스 온도와 임베딩 타이밍을 모두 정확하게 맞추는 것입니다. 일단 임베딩되면, 응집체는 광범위한 현미경 기술이나 NMR과 같은 다른 생물물리학적 방법을 사용하여 연구할 수 있습니다.

stabilizing-protein-proteinrna-condensates-low-melting-agarose

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연구

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Biochemistry

생화학

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단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 X 프로젝트에서 Fluorimetry

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

여기서는 NMR 방법론, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs(REDIFINE), 그리고 SEmi-고체 자화전이(CONDENSE-MT)에 의한 콘덴세이트 DEtectioN 프로토콜을 제시하여, 이상 조건에서 표지 없이 생체분자 응축액을 정량적으로 특성화할 수 있게 하여 분자 분열 분배, 교환 역학, 응축물 수화, 방울 구조를 침전이나 표지 없이 밝힐 수 있게 합니다.

용액 NMR을 이용해 이상성 조건에서 생체분자 응축액을 특성화하기

세포외 기질(ECM) 강성은 세포 행동의 핵심 조절 요인이지만, 근본적인 감지 및 전도 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이를 해결하기 위해, 세포-ECM 교차 대화에 대한 이해를 진전시키기 위해 강성을 조절할 수 있는 폴리아크릴아마이드 및 실리콘 기반 기판을 생성하는 프로토콜을 제공합니다.

세포 생물학 응용을 위한 명확한 강성을 가진 폴리아크릴아마이드 및 실리콘 세포외기질 기질 생성

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저융 아가로스 하이드로겔에서의 단백질 안정화 및 단백질—RNA 응축액 정량 생물물리학적 측정

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