단백질의 전기 영동 분리

복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 것은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis), 즉 PAGE라고 알려진 겔 전기영동을 통해 수행할 수 있으며, 단백질은 전기장에 반응하여 겔 매트릭스의 기공을 통해 이동합니다. 겔 기공의 크기와 단백질의 전하, 크기 및 모양의 조합이 단백질의 이동 속도를 결정합니다. 본 영상에서는 단백질의 전기영동 분리 방법을 시연하겠습니다.

안녕하세요, 저는 Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences 단백질체학 센터의 Bobul Chakravarti 박사입니다. 오늘은 1D 젤 전기영동 수행 절차를 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

먼저, 깨끗한 유리판 두 장과 1.5 millimeter 스페이서 두 개를 사용하여 제조사의 지침에 따라 전기영동 장치의 유리판 샌드위치를 조립하십시오. 이제 유리판 샌드위치를 캐스팅 스탠드에 고정합니다. 다음으로, 기존 프로토콜에 설명된 분리 젤 용액을 준비하십시오.

지정된 양의 10% 황산암모늄과 TEMED를 용액에 첨가하고 부드럽게 저어 섞습니다. 아크릴아마이드의 농도가 높기 때문에 탈기 과정은 필요하지 않습니다. 10 mL 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여, 유리판 사이의 용액 높이가 약 11 cm가 될 때까지 분리 젤 용액을 스페이서의 한쪽 가장자리를 따라 샌드위치에 즉시 분주합니다.

다음으로, 다른 피펫을 사용하여 겔 윗부분을 약 1cm 두께의 물 포화 이소부틸 알코올 또는 증류수로 천천히 덮습니다. 스페이서의 한쪽 가장자리를 따라 조심스럽게 층을 만든 후 반대쪽도 동일하게 처리하여 겔이 30~60분 동안 중합되도록 합니다. 실온에서 물 층을 덮어주면 아크릴아마이드 겔이 직선으로 중합됩니다.

겔이 중합되면 스태킹 겔을 부을 준비가 된 것입니다. 먼저 증류수 층을 따라내고, pH 8.8의 1x Tris-Cl in SDS로 헹굽니다. 이제 현재 프로토콜에 명시된 대로 스태킹 겔 용액을 준비하십시오.

다음으로, 플라스틱 피펫을 사용하여 스태킹 젤 용액이 스페이서 한쪽 가장자리를 따라 샌드위치 중앙으로 천천히 흘러 들어가게 하여, 샌드위치 내 용액의 높이가 플레이트 상단에서 약 1cm가 될 때까지 채웁니다. 이때 스태킹 젤에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 젤을 부은 후, 스태킹 젤 용액 층에 0.75 mm 테플론 콤을 삽입합니다.

스태킹 겔 용액을 상온에서 30~45분 동안 중합시킵니다. 이제 단백질 시료를 준비할 차례입니다. 단백질 시료 준비를 시작하기 위해, 분석할 단백질 시료의 일부를 2X SDS 시료 버퍼와 1:1 비율로 희석합니다.

단백질 농도가 낮은 용액의 경우, 단백질과 6× SDS 샘플 완충액을 5:1 비율로 혼합하여 사용하는 것을 고려하십시오. 샘플이 침전된 단백질 펠릿 형태라면, 1× SDS 샘플 완충액 50 to 100 µL에 단백질을 녹이십시오. 그런 다음, 밀폐된 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브에 샘플을 넣고 항온수조에서 100 °C로 3 to 5분 동안 가열하십시오.

다음으로, 폴리아크릴아미드 웰의 가장자리가 찢어지지 않도록 테플론 콤을 조심스럽게 제거합니다. 콤을 제거한 후, 웰을 1X SDS 전기영동 완충액으로 헹굽니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 웰을 1X SDS 전기영동 완충액으로 채웁니다.

웰을 헹구고 버퍼로 채운 후, 겔 샌드위치를 상부 버퍼 챔버에 장착합니다. 제조사의 지침에 따라 하부 버퍼 챔버에 권장량의 1X SDS 전기영동 버퍼를 채웁니다. 그다음, 상부 버퍼 챔버에 장착된 샌드위치를 하부 버퍼 챔버에 넣습니다.

이제 상단 버퍼 챔버를 1X SDS 전기영동 버퍼로 완전히 채워 스태킹 젤의 샘플 웰에 버퍼가 가득 차도록 합니다. 이제 젤 로딩 팁이 장착된 25 또는 100 µL 자동 피펫을 사용하여 시료를 로딩할 준비가 되었습니다. 단백질 샘플을 하나 이상의 웰에 조심스럽게 얇은 층으로 바닥에 도포하여 로딩하십시오. 컨트롤 웰에는 분자량 표준물질을 로딩합니다.

또한 인접한 레인의 시료가 퍼지는 것을 방지하기 위해 빈 웰에 1X SDS 샘플 버퍼를 동일한 부피로 추가합니다. 이제 젤 전기영동을 시작할 준비가 되었습니다. 젤을 가동하려면 전원 공급 장치를 셀에 연결하고, 두께가 1.5 mm인 슬랩 젤의 경우 30 mA의 정전류로 가동하십시오.

멘톨 블루 추적 염료가 분리 겔의 바닥에 도달하면 전원 공급 장치를 분리하십시오. 겔 전기영동이 완료되었으므로, 전기영동 완충액을 버리고 겔 샌드위치가 부착된 상단 완충액 챔버를 제거하십시오. 샘플 웰의 순서를 확인할 수 있도록 겔의 방향을 맞추십시오.

그런 다음 상부 완충액 챔버에서 샌드위치를 꺼내 흡수지나 종이 타월 위에 올려놓습니다. 다음으로, 스페이서 중 하나를 샌드위치 가장자리에서 전체 길이를 따라 절반 정도 조심스럽게 밀어냅니다. 노출된 스페이서를 지렛대로 사용하여 유리판을 들어 올리고, 겔을 조심스럽게 노출시킵니다.

하단 플레이트에서 젤을 꺼냅니다. 염색 및 건조 과정에서 레인 방향을 잃지 않도록 젤의 한쪽 모서리를 작은 삼각형 모양으로 잘라냅니다. 이제 젤 전기영동 절차가 완료되었습니다.

이제 다양한 단백질 검출 절차를 사용하여 겔을 처리할 수 있습니다. 지금까지 겔 전기영동을 이용하여 단백질을 분리하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.