젤의 단백질 염색법

이전 영상인 '단백질의 전기영동 분리'에서, 우리는 겔 전기영동을 통해 복잡한 단백질 혼합물을 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이번 영상에서는 겔 내 단백질의 위치를 시각화하기 위한 네 가지 서로 다른 겔 염색 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 KEG 대학원의 Proteomics Center와 협력하고 있는 UVP의 Sean Gallagher입니다.

오늘은 전기영동으로 분리된 단백질을 시각화하는 여러 가지 기술을 보여드리겠습니다. 여기에는 Coomassie blue silver staining, cyro orange 및 cyro ruby가 포함됩니다. 그럼 먼저 Coomassie blue부터 시작하겠습니다.

Coomassie blue 염색을 이용한 겔 내 단백질 밴드 검출은 염료의 비특이적 결합에 의존합니다. 본 실험에서는 Coomassie brilliant blue G-250을 사용하였습니다. 이 방법에서는 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리된 단백질을 고순수수로 세척합니다.

그 다음, 수성 kamasi blue 염색법을 사용하여 단백질의 위치를 검출합니다. 검출 한계는 단백질 밴드당 0.3 ~ 1 µg입니다. 먼저, 전기영동으로 단백질이 분리된 폴리아크릴아미드 겔을 준비합니다.

천천히 교반하면서 폴리아크릴아마이드 겔을 300 mL의 고순수 물이 담긴 플라스틱 용기에 넣습니다. 5분 동안 둡니다. 물을 버리고 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.

물을 따라내고 젤이 잠기도록 Kamasi blue 염색액을 붓고 천천히 흔들어주며 1시간 동안 염색합니다. 1시간 후 염색액을 따라냅니다. 젤을 약 200 milliliters의 물에 30분 동안 담가 짧게 헹굽니다. 이 단계에서 젤을 물에 보관하여 추후 이미징에 사용할 수 있습니다.

영구적인 겔 기록을 유지하기 위해 이 단계에서 겔을 건조할 수 있습니다. 이를 위해 겔을 두 장의 Watman 3mm 필터 페이퍼 위에 놓고 윗부분을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 그런 다음 일반적인 겔 건조기에서 약 80 °C로 1~2시간 동안 건조하십시오.

또 다른 단백질 염색 방법은 은 염색법이며, 다음 단계에서 이를 시연하겠습니다. Coomassie blue 염색법이 더 쉽고 빠르지만, 은 염색법은 검출 한계가 0.3 nanograms BSA로 상당히 더 민감합니다. 은 염색법을 통한 겔 내 단백질 밴드 검출은 단백질의 다양한 화학적 그룹에 은이 결합하는 원리에 기반합니다.

다음 프로토콜은 Invitrogen사의 Silver Quest silver staining kit를 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 약 30분이 소요되는 fast staining 프로토콜에서 파생되었으며, 질량 분석법과 호환되는 silver staining용 키트 기반 화학 분석법 중 하나입니다. 본 과정에서는 silver staining을 시작하기 전 Invitrogen사의 precast mini gel을 사용하겠습니다.

지문 오염을 방지하기 위해 항상 장갑을 착용하십시오. 100 milliliters의 시약급 물이 담긴 전자레인지 전용 트레이에 겔을 넣습니다. 짧게 헹군 후 물을 따라내십시오.

다음으로, 40% ethanol과 10% acetic acid가 초순수에 포함된 고정액 100 milliliters를 첨가하고 30초 동안 전자레인지로 가열합니다. 전자레인지 과정은 결합과 염색을 가속화하여 필요한 배양 단계를 단축시킵니다. 이 시점에서 겔을 셰이커에 놓고 5분 동안 천천히 흔들어 줍니다.

5분 후, 고정액을 따라 버리고 30% ethanol 100 mL를 가하여 겔을 세척한 다음, 전자레인지에 30초 동안 가열하고 셰이커에서 5분 동안 반응시킵니다. 5분 후, ethanol을 따라 버립니다. 이제 감작제(sensitizing reagent) 100 mL를 가하여 전자레인지에 30초 동안 가열한 후, 셰이커에서 2분 동안 반응시킵니다.

2분 후, 감작 시약을 따라 버립니다. 시약급 물 100 milliliters를 넣고 30초 동안 전자레인지에 돌린 후, 셰이커에서 2분 동안 흔들어 줍니다. 액체를 따라 버리고 이 과정을 총 2회 반복하여 세척합니다.

이제 염색액 100 milliliters를 넣고, 30초 동안 전자레인지로 가열한 후 5분 동안 천천히 흔들어 섞어줍니다. 5분이 지나면 염색액을 따라내어 버립니다. 시약급 물 100 milliliters를 넣고, 전자레인지 단계는 생략한 채 즉시 쉐이커에 올려 20초에서 60초 동안 작동시킵니다.

물을 버리고 즉시 현상액 100 milliliters를 첨가하여 단백질 밴드가 보일 때까지 현상합니다. 배경이 깨끗하게 유지되는 상태에서 이는 약 5~10분 정도 소요됩니다. 최상의 결과를 얻으려면 이 시점에서 정지액 10 milliliters를 현상액에 첨가하여 현상을 중단하십시오.

색 강도의 미세한 변화가 발생하거나 비특이적 배경 요소가 증가할 수 있으므로 가능한 한 빨리 젤을 촬영하십시오. 시간이 지남에 따라 확인하게 되는 젤에는 잔류 단백질이 포함되어 있습니다. 전기 블로팅 후, 영구적인 기록을 유지하기 위해 젤을 건조시키거나 밀봉 가능한 플라스틱 백에 보관하십시오. 다음으로, 젤을 형광 염색하는 방법을 설명하겠습니다.

형광 염료는 전통적인 단백질 염색법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 본 과정에서 다룰 Cipro orange 단백질 젤 염색법은 밴드당 1~2 ng의 단백질을 검출할 수 있습니다. 이는 Coomassie brilliant blue 염색보다 민감도가 높으며, 많은 은 염색법(silver staining)과 대등한 수준의 민감도를 가집니다.

형광 염색은 일반적인 은 염색 프로토콜보다 직접 조작하는 시간이 적어 간단하며, 1시간 이내에 완료됩니다. 염색된 단백질은 표준 300 nm UV transluminator 또는 레이저 스캐너를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 본 과정에서는 다시 한번 Invitrogen precast mini gel을 사용하여 SDS-PAGE로 단백질을 준비하고 분리하겠습니다.

단, 배경 형광을 줄이기 위해 러닝 버퍼(running buffer)에 평소 사용하는 0.1% SDS 대신 0.05% SDS를 사용하십시오. 염색 절차를 시작하려면 표준 크기의 미니 젤 1~2개를 담을 수 있는 작은 플라스틱 용기에 cipro orange 형광 염색액을 붓습니다. 염색액은 약 50 milliliters를 사용하십시오.

세척제는 염색을 방해하므로, 사용 전 염색 접시를 깨끗이 세척하고 충분히 헹구어야 한다는 점에 유의하십시오. 이제 겔을 염색 용액에 넣습니다. 염료를 강한 빛으로부터 보호하기 위해 용기를 알루미늄 호일로 덮어줍니다.

실온에서 겔을 40분에서 60분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 염색액을 버린 후, 7.5% acetic acid 약 100 milliliters로 1분 미만 동안 겔을 헹구어 겔 표면의 과잉 염색물을 제거합니다. 단백질 밴드를 시각화하고 촬영하기 위해 0.1% tween 20에서 하룻밤 동안 배양하여 겔을 처리합니다. 형광 표지된 겔을 표준 300 nanometer transluminator 또는 blue light transluminator 위에 직접 놓습니다.

다음으로 Cipro ruby 형광 염료를 사용하는 대체 형광 염색 방법을 시연하겠습니다. Cipro ruby 염색법은 특히 2차원 전기영동(two dimensional page)에서 사용하기 위해 설계되었으나, 표준 1차원 SDS page에서도 가장 민감한 단백질 젤 염색법임이 입증되었습니다. 먼저 젤을 적절한 크기의 깨끗한 폴리프로필렌 또는 PVC 접시에 옮기십시오.

gel을 적절한 양의 희석되지 않은 cipro ruby protein gel stain에 넣고, orbital shaker에서 50 RPM으로 천천히 지속적으로 교반하며 배양합니다. gel을 덮은 후 최소 3시간 동안 배양합니다. gel을 깨끗한 염색 용기로 옮겨 10% methanol, 7% acetic acid 용액으로 한 번 세척한 후, gel을 회수하여 다시 rocker 위에 올리고 30분 동안 둡니다.

배경 형광을 줄이고 감도를 높였으므로, 이제 겔을 관찰하고 촬영할 준비가 되었습니다. 오늘 프로토콜을 시청해 주셔서 감사합니다. 지금까지 전기영동 후 단백질을 시각화하기 위한 여러 가지 다양한 절차를 보여드렸습니다.

형광 염색 및 은 염색과 같이 매우 민감한 방법들이 있는 반면, 쿠마시 블루 염색과 같이 일상적으로 사용되는 방법들도 있습니다. 시약의 순도가 매우 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 초순수 사용과 각 단계별 처리 시간을 정확히 지키는 것 또한 매우 중요합니다.

재현 가능한 결과 또한 얻기 위해서는 이 점에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 이상으로 마치며, 다음 실험에서도 좋은 결과 있으시길 바랍니다.