젤의 단백질 염색법

단백질의 전기영동 분리라는 제목의 이전 비디오에서는 겔 전기영동을 사용하여 복잡한 단백질 혼합물을 분리할 수 있는 방법을 보여주었습니다. 이 비디오에서는 겔 내 단백질의 위치를 시각화하기 위한 4가지 겔 염색 방법을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 KEG 대학원 연구소의 단백질체학 센터에서 일하는 UVP의 Sean Gallagher입니다.

오늘은 전기영동으로 분리 후 단백질을 시각화하는 여러 가지 기술을 보여드리겠습니다. 여기에는 카마시 블루 실버 스테인, 사이로 오렌지 및 사이로 루비가 포함됩니다. 그럼 카마시 블루 퍼스트부터 시작하겠습니다.

Kamasi blue staining에 의한 겔에서 단백질 금지의 검출은 염료의 비특이적 결합에 따라 달라집니다. 이 경우, 카마시 브릴리언트 블루 G 투 50. 이 방법에서는 폴리 아크릴아미드 겔에서 분리된 단백질을 고순도 물을 사용하여 세척합니다.

그런 다음 수성 카마시 블루 염색을 사용하여 단백질의 위치를 검출합니다. 검출 한계는 단백질 밴드당 0.3-1마이크로그램입니다. 시작하려면 단백질이 전기영동에 의해 분리된 폴리아크릴아미드 겔로 시작합니다.

천천히 교반하면서 폴리 아크릴아미드 겔을 300ml의 고순도 물로 채워진 플라스틱 용기에 넣습니다. 5분 동안 그대로 둡니다. 버리고 세 번째 세척 후 두 번 더 반복하십시오.

물을 붓고 젤을 카마시 블루 염색액으로 1시간 동안 덮고 염색 1시간 후 천천히 교반하면서 염색 용액을 붓습니다. 약 200ml의 물을 30분 동안 넣어 젤을 짧게 헹굽니다. 이 시점에서 젤은 향후 이미징을 위해 물에 저장될 수 있습니다.

겔은 영구적인 겔 기록을 유지하기 위해 이 단계에서 건조될 수도 있습니다. 이렇게하려면 Watman 3mm 여과지 두 장에 젤을 놓고 상단을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 그런 다음 기존 젤 건조기에서 약 섭씨 80도에서 1-2시간 동안 건조합니다.

또 다른 단백질 염색 방법은 은 염색에 의한 것으로, 다음에 시연할 것입니다. Kamasi 블루 염색 방법은 더 쉽고 빠르지만, 은 염색은 0.3 나노그램 BSA의 검출 한계로 훨씬 더 민감합니다. 은 염색에 의한 겔의 단백질 띠 검출은 단백질의 다양한 화학 그룹에 대한 은의 결합에 따라 달라집니다.

다음 프로토콜은 in Vitrogen의 Silver Quest 은 염색 키트를 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 약 30분 동안 진행되는 빠른 염색 프로토콜에서 파생되며 질량 분석법과 호환되는 은 염색에 사용되는 많은 키트 기반 화학 물질 중 하나입니다. 이 경우, 은 염색을 시작하기 전에 in vitrogen 프리캐스트 미니 젤을 사용할 것입니다.

지문 오염을 방지하기 위해 항상 장갑을 착용하십시오. 젤을 100ml 시약 등급의 물이 담긴 전자레인지 안전 트레이에 넣습니다. 간단히 헹구고 물을 붓습니다.

다음으로, 40% 에탄올, 10% 아세트산으로 구성된 100ml의 고정액을 고순도 물에 넣고 전자레인지에 30초 동안 넣습니다. 마이크로파 공정은 결합 및 염색을 가속화하여 필요한 배양 단계를 단축합니다. 이 시점에서 젤을 셰이커에 놓고 5분 동안 천천히 흔듭니다.

5 분 후, 정착제를 붓고 100 밀리리터, 30 % 에탄올을 첨가하여 젤 전자 레인지를 30 초 동안 세척 한 다음 젤을 5 분 동안 셰이커에 놓습니다. 5분 후 에탄올을 붓습니다. 이제 100ml의 감작 시약 전자레인지를 30초 동안 첨가한 다음 셰이커에 2분 동안 놓습니다.

2분 후, 감작 시약을 붓습니다. 100ml 시약 등급의 물 전자레인지를 30초 동안 넣고 셰이커에 2분 동안 놓습니다. 붓고 총 두 번의 세탁 주기 동안 반복합니다.

이제 염색 용액 100ml를 넣고 전자레인지에 30초 동안 돌린 다음 5분 동안 천천히 저어줍니다. 5분 후 염색 용액을 붓습니다. 100 밀리리터 시약 등급의 물을 넣고, 전자레인지를 건너뛰고, 단계를 밟아 셰이커에 직접 20-60초 동안 놓습니다.

물을 버리고 즉시 현상액 100ml를 첨가하고 단백질 띠가 보일 때까지 현상합니다. 배경이 선명하게 유지되면 약 5분에서 10분 정도 걸립니다. 이 시점에서 개발자에 10ml의 스토퍼 솔루션을 추가하여 최상의 결과를 위해 개발을 중단하십시오.

색상 강도에 약간의 변화가 있고 불특정 배경 요소가 증가할 수 있으므로 가능한 한 빨리 젤 사진을 촬영하십시오. 시간이 지남에 따라 보고 있는 젤에는 잔류 단백질이 포함되어 있습니다 전기 블로팅 후 젤을 건조시켜 영구 기록을 유지하거나 밀봉 가능한 비닐 봉지에 보관하십시오. 다음으로, 겔을 형광 염색하는 방법을 보여줍니다.

형광 염료는 기존의 단백질 염색에 비해 많은 장점이 있습니다. 여기에서 간략하게 설명할 Cipro 오렌지 단백질 젤 염색은 밴드당 1-2나노그램의 단백질을 검출할 수 있습니다. 이것은 kamasi brilliant blue 염색보다 더 민감하고 많은 은 염색 기술만큼 민감합니다.

형광 염색은 일반적인 은 염색 프로토콜보다 손에 덜 소요되는 방식으로 간단하며 1시간 이내에 완료됩니다. 염색된 단백질은 표준 300나노미터 UV 투과기 또는 레이저 스캐너를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 이 경우, 우리는 다시 시험관 내 프리캐스트 미니 겔을 사용하여 SDS 페이지를 사용하여 단백질을 준비하고 분리하기 시작할 것입니다.

그러나 배경 형광을 줄이기 위해 일반적인 0.1% SDS 대신 실행 버퍼에서 0.05% SDS를 사용하십시오. 염색 절차를 시작하려면 cipro orange 형광 염색 용액을 작은 플라스틱 접시에 붓고 표준 크기의 미니 젤 1개 또는 2개를 만듭니다. 약 50ml의 염색 용액을 사용하십시오.

얼룩이 있는 접시는 세제가 얼룩을 방해할 수 있으므로 사용하기 전에 잘 세척하고 헹궈야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이제 젤을 염색 용액에 넣습니다. 염료를 밝은 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 용기를 덮으십시오.

실온에서 40-60분 동안 젤을 부드럽게 저어줍니다. 염색 용액을 버리고 7.5% 아세트산, 약 100밀리리터로 겔을 1분 미만으로 헹구어 겔 표면의 과도한 얼룩을 제거하고 0.1% 트윈 20에서 하룻밤 동안 배양하여 겔을 억류하여 단백질 밴드를 시각화하고 사진을 찍습니다. 형광 표지된 젤을 표준 300나노미터 투광기 또는 청색광 투광기에 직접 놓습니다.

다음으로, Cipro 루비 형광 염료를 사용하는 대안적인 형광 염색 방법을 시연합니다. Cipro 루비 염색 방법은 2차원 페이지에 사용하도록 특별히 설계되었지만, 표준 1차원 SDS 페이지에 가장 민감한 단백질 겔 염색으로 입증되었습니다. 시작하려면 젤을 적절한 크기의 깨끗한 폴리프로필렌 또는 PVC 접시에 옮깁니다.

적당량의 희석되지 않은 시프로 루비 단백질 젤 염색을 50RPM의 오비탈 셰이커에서 지속적으로 부드럽게 교반하여 겔을 배양합니다.겔을 덮고 최소 3시간 동안 배양합니다. 젤을 깨끗한 염색 접시에 옮기고 10% 메탄올, 7% 아세트산 용액에서 한 번 씻고 복구하여 젤을 30분 동안 로커에 다시 놓습니다.

배경 형광을 줄이고 감도를 높이기 위해 이제 젤을 보고 사진을 찍을 준비가 되었습니다. 오늘의 프로토콜을 시청해 주셔서 감사합니다. 전기영동 후 단백질을 시각화하기 위한 다양한 절차를 보여드렸습니다.

일부는 형광 염색 및 은 염색과 같이 매우 민감하고 일부는 카마시 블루 염색과 같은 일상적인 염색입니다. 시약의 순도가 매우 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 초순수를 사용하는 것도 매우 중요하며 각 단계의 타이밍도 중요합니다.

재현 가능한 결과를 얻으려면 세심한주의를 기울여야합니다. 이것으로 다음 실험에서 행운을 빕니다.