Name: Mycobacteria의 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 마이코박테리아의 전기천공법을 이용한 유전자 변형 기술을 Mycobacterium smegmatis를 활용하여. 이 최적화된 프로토콜은 두꺼운 세포벽과 느린 성장 속도를 가진 균주의 효율적인 DNA 도입을 가능하게 합니다.

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mycobacteria의 electroporation

Electroporation of Mycobacteria

고효율 변환 mycobacteria 연구의 주요 제한 사항입니다. 속 Mycobacterium는 변환하기 어려울 수 있으며, 이것은 주로 두께와 밀랍 세포 벽에 의해 발생하지만, 대부분의 분자 기법과 같은 대장균 및 바실러스 subtilis와 같은 먼 관련 종족에 대한 개발되어있다는 사실에 의해 복합이다. 이러한 장애물에도 불구하고, mycobacterial plasmids가 확인되었습니다 많은 mycobacterial 종의 유전자 변형은 지금 설명하고 있습니다. mycobacteria에 DNA를 도입하는 가장 성공적인 방법은 electroporation입니다. 많은 매개 변수는 성공적인 변화에 기여하는, 이들은 종 / 변형, 변형 DNA의 특성, 사용되는 선택 마커, 성장 매체와 electroporation 펄스에 대한 조건이 포함됩니다. 모두 느린 - 빠른 재배자 변환을위한 최적의 방법은 여기에 자세한 내용 있습니다. 다른 mycobacterial 종족에 대한 다양한 선택 마커로 변환 효율이보고됩니다.

Mycobacterial 병원성 전략이 제대로 이해 남아있다. 대부분의 종의 느린 성장 속도, 세포 벽 뚫리지 자연과 병원균 작업의 위험이 연구 mycobacteria 어렵게하고 이러한 생물 우리의 가난한 이해하기위한 대부분 책임이 있습니다. 이 비디오에서 우리는 DNA의 항목을 허용하는 간단한 높은 전기 충격을 쓰는 세포를 포함 electroporation의 기술을 보여줄 것입니다. 그것은 mycobacterial 세포에 DNA를 도입을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다.

Mycobacteria의 Electroporation

고효율 형질전환은 마이코박테리아(mycobacteria) 연구의 주요 제약 요인입니다. 마이코박테리움(Mycobacterium) 속은 형질전환이 어려울 수 있으며, 이는 주로...

대부분의 마이코박테리아 종의 느린 성장 속도로 인해 이들의 병원성 전략에 대한 이해는 여전히 부족한 실정입니다. 세포벽의 불투과성과 병원체 취급 시의 위험성으로 인해 마이코박테리아 연구는 어려우며, 이는 이러한 미생물에 대한 이해가 낮은 주요 원인이 됩니다. 본 영상에서는 세포에 짧고 강한 전기 펄스를 가하여 DNA가 유입되도록 하는 전기 천공법(electroporation) 기술을 시연하겠습니다.이 방법은 마이코박테리아 세포에 DNA를 도입하는 데 가장 널리 사용되는 방법입니다. 안녕하세요, 저는 Barts and the London School of Medicine and Dentistry의 감염병 센터, Tanya Parish 연구실의 Ron Good입니다. 오늘은 마이코박테리아의 전기천공법 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 결핵균(microbacterium tuberculosis)을 연구하고 있지만, 해당 균주는 병원성이 매우 높고 BSL-3 격리 시설이 필요하므로, 여기서는 비병원성 균주인 microbacterium m Mcma를 사용하여 이 기술을 보여드리겠습니다. 이제 박테리아를 전기천공하겠습니다. 마이코박테리아를 전기천공하려면 먼저 컴피턴트 셀(competent cells)을 만들어야 합니다.병원성 마이코박테리아는 중대한 생물학적 위험 요소라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 모든 배양 및 유전자 조작은 적절한 밀폐 시설 내에서 수행되어야 합니다. 1등급 안전 작업대 내부 시설을 이용해야 하며, 위험성 평가는 병원성 마이코박테리아를 이용한 모든 실험의 첫 단계가 되어야 합니다.이를 제작하기 위해, 먼저 실험실에서 고체 배지로 유지해 온 배양물을 사용합니다. 5 mL의 Lemko-Dittrich 배지에 Tween 80 육수를 포함시킨 튜브에 루프 가득 mycobacteria를 접종합니다. 많은 mycobacteria는 상대적으로 성장이 느린 유기체이므로, mycobacteria보다 빠르게 성장하여 배양물을 오염시킬 수 있는 박테리아나 곰팡이의 유입을 막기 위해 철저한 무균 조작법을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 하나가 오염될 경우를 대비해 중복 배양물을 준비하는 것이 바람직합니다.마이코박테리아 세포는 두꺼운 왁스층으로 인해 배양 시 서로 뭉치는 경향이 있습니다. Vortexing과 Tween 80과 같은 비이온성 계면활성제 첨가는 이러한 응집을 줄여 세포의 더 균질한 현탁액을 만들어 줍니다. 접종 후, 배양액을 37 °C에서 100 RPM으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양하십시오.스타터 배양액이 성장한 후, 250 mL 코니컬 플라스크에 약 100 mL의 lemko tw를 넣고 하룻밤 배양한 배양액을 1:100 비율로 희석하여 접종합니다. 37 °C에서 흔들어주며 약 16~24시간 동안 계속 배양하며, 이 때 분광광도계를 사용하여 광학 밀도를 확인합니다. 수치가 0.8에서 1 사이이면 세포가 최적의 대수 성장기에 있는 것입니다.그 후, 세포를 수확하기 전 얼음 위에서 1.5시간 동안 배양하며, 이는 형질전환 효율을 4배 높이는 데 도움이 됩니다. 얼음 위에서 더 오래 배양하면 효율이 감소합니다. 다음으로, 배양액을 큰 원심분리 튜브에 부어 세포를 수확합니다.300 Gs에서 10분간 원심분리한 후, 얼음처럼 차가운 10% glycerol로 세포를 세 번 세척합니다. 이때 매 세척 시마다 부피를 줄여서, 배양 부피가 100 mL인 경우 첫 번째 세척에는 20 mL, 두 번째에는 10 mL, 마지막 세척에는 5 mL를 사용합니다. 세척 후에는 세포를 원래 부피의 1/10에서 1/100에 해당하는 얼음처럼 차가운 10% glycerol에 재현탁합니다. 이 단계에서 세포를 소분하여 냉동한 후, 향후 사용을 위해 -70 °C에서 보관할 수 있습니다.형질전환 효율은 세포를 동결한 후에 흔히 증가합니다. 이러한 컴피턴트 세포(competent cells)를 사용하기 전에는, 해동 후 원심분리로 회수하여 신선한 10% glycerol에 재현탁해야 합니다. 전기 천공법(electroporation)을 위해, 2.5 kV의 고전압 펄스를 전달할 수 있는 장치인 전기천공기를 사용합니다.킬로볼트(Kilovolts) 전압이 사용됩니다. 박테리아와 DNA를 전기천공법용 큐벳에 넣습니다. 서로 다른 큐벳 간에 간격이나 경로 길이는 동일할 수 있으나, 담을 수 있는 부피는 서로 다릅니다.우리는 세포를 전기 천공하기 위해 0.2 cm 큐벳에 200 µL의 세포를 통상적으로 사용합니다. 먼저, 염 및 기타 오염 물질이 없는 상태로 DNA 샘플을 준비하십시오. 이는 전기 천공 중에 아킹(arcing)이 발생할 가능성을 최소화하는 데 중요합니다.박테리아를 포어링(poring)하기 전에 DNA 샘플의 순도가 높은지 확인하십시오. 260/280 흡광도 비율은 1.8에 가까워야 합니다. 5 μL 이하의 부피에 포함된 0.5~5 μg의 염 제거 DNA를 200 μL의 미세 박테리아 현탁액에 추가하십시오. 항생제 내성 돌연변이의 빈도를 확인하기 위해 DNA를 넣지 않은 대조군 전기 천공법(electroporation)을 포함할 수 있습니다.그 후 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 방치합니다. 이는 샘플 내의 생존 세포와 DNA 용액의 염 농도를 낮추어, 얼음 배양 후 발생할 수 있는 아킹(arcing) 현상을 최소화하기 위함입니다. 고전압 펄스를 가하기 전, 파이펫이나 볼텍스(vortex)를 사용하여 세포를 완전히 재분산시켜 세포를 재현탁하고 DNA가 잘 혼합되도록 합니다. 세포가 응집되면 아킹이 발생하여 형질전환 효율이 저하될 수 있습니다.다음으로, 혼합물을 미리 냉각시킨 0.2 centimeter 전극 간격 qve로 옮깁니다. 이때 혼합물에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 이는 아킹(arcing) 현상을 줄이기 위함이기도 합니다.qve를 펄스 챔버에 넣기 전에 외관이 완전히 건조되었는지 확인하십시오. qve를 충분히 건조시킨 후, 펄스 컨트롤러의 저항을 1,000 $\Omega$으로 설정하고 qve를 전기천공 챔버에 넣으십시오. 그런 다음 전압을 2.5 kV로 설정하고, QVE 내부의 커패시터가 방전되었음을 알리는 비프음이 들릴 때까지 펄스를 가하십시오.시정수가 10보다 크면 전기천공이 성공한 것으로 간주합니다. 전기천공 실패는 보통 스파크를 일으키는 아킹(arcing)으로 나타나며, 이는 흔히 방지할 수 있습니다. 펄스 컨트롤러의 저항값을 변경한 후, Q vet을 다시 얼음 위에 10분 동안 둡니다.배양 후, 세포 현탁액을 5 mL의 lemko TW 배지가 들어 있는 멸균 유니버설 병으로 옮깁니다. 세포의 회복을 돕고 형질전환체의 생존율을 높이기 위해 펄스 처리 직후 세포를 최소 10배 희석하는 것이 중요합니다. 그다음, 세포를 37 °C에서 2~3시간 동안 배양하며, 배양이 끝나면 도말 준비가 완료됩니다. 배양 후, 3000 ×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다.원심분리 후, 각 플레이트에 30~300개의 콜로니가 형성될 수 있도록 lemko broth를 사용하여 현탁액을 적절히 희석합니다. 내성 콜로니가 단일 세포로부터 유래했는지 확인하는 것이 중요하므로, 플레이팅 전에 세포를 완전히 재현탁시켜야 합니다. 세포를 희석하지 않으면 감수성 세포의 배경 런(lawn)으로 인해 실제 내성 콜로니를 시각화하기 매우 어려울 수 있습니다. 이제 적절한 항생제가 포함된 lemko agar에 세포를 플레이팅합니다.콜로니가 보일 때까지 플레이트를 37 °C에서 배양합니다. 콜로니가 성장하는 데 3~5일이 소요됩니다. 형질전환체를 계수합니다.형질전환 효율을 계산하기 위해서입니다. 형질전환 효율에는 여러 요인이 영향을 미칩니다. 여기에는 세포를 수확할 때의 성장 단계, 전기천공법 배지, 그리고 인가된 펄스의 전기장 강도와 시간 상수가 포함됩니다.전기천공법의 효율은 형질전환에 사용되는 DNA의 선택뿐만 아니라, 때로는 선택 마커의 선택에 따라서도 달라집니다. 당사는 ems magma에서 hygromycin 또는 streptomycin 내성을 이용하여 일반적으로 마이크로그램당 DNA 기준 10⁵에서 10⁶개의 콜로니 효율을 얻습니다. 이제 형질전환체를 배양하기 위해 전기천공된 mycobacteria를 선택 배지가 포함된 고체 배지에 스트리킹합니다.항생제가 포함된 배지에서 37°C로 2~3일 동안 배양합니다. 2~3일의 배양 후, 대부분의 응용 분야에서 요구하는 대로 형질전환체를 분석할 수 있으며, 보통 3개의 형질전환체를 스트리킹하여 분석해야 합니다. 형질전환 후 염색체 외 플라스미드의 정체성을 확인하는 것이 중요합니다.결실과 재배열이 흔히 발생하므로, 방금 mycobacterium s magma를 전기천공하는 방법을 보여드렸습니다. 병원성 mycobacteria를 사용하여 이 절차를 수행할 경우에는 적절한 안전 조치를 취해야 함을 기억하십시오. 이것으로 모두 끝났습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Stefan, A., et al., 대장균에서 단백질 공동 발현의 다면적인 이점. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포 준비, 전기천공, 회수 및 형질전환체 선택을 포함하여 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드로 대장균 을 형질전환하는 절차를 보여줍니다.

고전압 전기천공법을 이용한 박테리아의 제조 및 형질전환

일렉트로 변형으로 알려진 공정에서 박테리아로 DNA를 도입하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. electrocompetent 세포의 제조를위한 기존의 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 문서는 다른, 빠른, 그리고 현재 일부 실험실에서 사용 electrocompetent 세포의 준비를위한 효율적인 방법을 설명합니다.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.

연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.

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이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

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세틸트리메틸암모늄 브로마이드 기법을 이용한 마이코박테리아 종에서 전체 게놈 디옥시리보핵산 추출

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

배우세요 마이코박테리아의 전기천공법을 이용한 유전자 변형 기술을 Mycobacterium smegmatis를 활용하여. 이 최적화된 프로토콜은 두꺼운 세포벽과 느린 성장 속도를 가진 균주의 효율적인 DNA 도입을 가능하게 합니다.

Mycobacteria의 Electroporation

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