마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

안녕하세요, 저는 뉴캐슬 대학교의 인간 유전학 연구소와 북동 잉글랜드 줄기세포 연구소의 Maya Sibu Bloom입니다. 그리고 여기 계신 분은 위스콘신 의과대학 소속이십니다. 오늘은 생쥐의 Visco 난포로부터 Al Explan을 준비하는 절차를 보여드리겠습니다.

B Explan은 표피 신경릉 줄기세포 배양을 준비하기 위한 시작 조직입니다. 이 과정은 수염 패드를 해부하고 모낭을 미세 해부한 후, BUL을 분리하여 배양 접시에 배치하는 단계를 포함합니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차는 성체 마우스의 수염 모낭에서 벌지(bulge)를 박리하는 것으로 시작합니다. 일반적으로 2~6개월령의 마우스를 사용하지만, 더 어린 마우스일수록 더 많은 줄기세포를 얻는 경향이 있습니다. 동물은 소독을 위해 Betadine과 과산화수소의 1:1 혼합액에 약 3분 동안 완전히 담근 후, 마우스 전체, 특히 안면 부위에 75% ethanol을 분사하고 마우스를 해부 현미경으로 옮깁니다.

층류 정화 작업대(laminar flow hood) 내에서, 모구(hair bulbs)가 잘리지 않도록 주의하며 WHI 패드를 조심스럽게 절개하고, 실온의 항衡량 염류 용액(Hanks balanced salt solution)에 넣습니다. WHI 모낭을 절개하려면 핀셋으로 모낭 옆의 피부를 잡은 다음, 직선 가위로 모낭 주변을 절개하십시오. 이때 깊게 절개해야 합니다.

모낭에 손상을 주지 않도록, 수염 모낭을 수염 패드에서 들어 올려 새 플레이트에 옮깁니다. 신선한 HBSS를 사용하여 동일한 플레이트 내의 모낭들을 끌어당깁니다. 날카롭게 다듬은 핀셋과 바늘을 사용하여 모낭을 HBSS가 담긴 실크 가드 코팅 유리 페트리 접시에 고정합니다.

수염 모낭이 깨끗해질 때까지 버퍼를 분사하여 헐거운 지방 조직과 진피 조직을 씻어냅니다. 필요한 경우, 수염 모낭으로 연결되는 신경을 절단하고, 긁어내기와 HBSS를 이용한 반복적인 세척을 통해 부착된 조직을 제거합니다. 마이크로 블레이드로 수염 모낭을 세로 방향으로 절단합니다.

돌출부를 손상시킬 수 있으므로 너무 깊게 절개하지 마십시오. 혈액이 더 이상 보이지 않을 때까지 HBSS를 반복적으로 분사하여 제거합니다. 혈액이 나타나는 것은 절개 깊이가 충분하다는 좋은 지표가 됩니다.

다음으로, 원추동(coness sinus) 상단 부위에서 횡단면 절개를 수행하고, 이어서 분리된 모낭 조각 내의 피부와 매우 가까운 환상동(ring sinus) 수준에서 두 번째 횡단면 절개를 수행합니다. 이제 캡슐 내부에 돌출부가 보일 것입니다. 여기 바로 그것이 있습니다.

포셉으로 캡슐의 끝부분을 잡고 돌출부를 제거합니다. 그러면 비어 있는 캡슐과 분리된 돌출부 풀(pool)이 보일 것입니다. 분리된 돌출부는 실온의 HBSS가 담긴 별도의 배양 플레이트에 보관합니다.

풀링된 팽대부(bulges)에 다른 조직이 섞이지 않도록 주의하십시오. 이 시점에서 팽대부 식물은 In bul 식물 배양 전 단계로 배양할 수 있습니다. 35 millimeter 배양 플레이트는 50 microliter의 콜라겐과 10 microliter의 멸균액 방울을 떨어뜨려 콜라겐으로 코팅합니다.

6% 식염수를 서로 옆에 배치합니다. 이중 굴곡 포스터 피펫으로 잘 섞어준 뒤 배양 플레이트의 가장자리 쪽으로 밀어 넣고, 깨끗한 환경에서 하룻밤 동안 배양하되 마르지 않게 합니다. 이를 위해 바닥에 물 접시가 놓인 데시케이터를 사용합니다.

다음 날인 배양일에는 식염수로 플레이트를 헹구고, 콜라겐이 코팅되고 헹구어진 배양 플레이트를 인큐베이터 내의 배양 배지에서 약 3시간 동안 사전 배양합니다. 배양 배지는 85% alpha modified MEM, 10% fetal bovine serum 및 5% 11일차 닭 배아 추출물로 구성됩니다.

사전 배양 후, 플레이트에서 배양액을 제거하고 최소한의 배양액과 함께 여러 개의 BUL을 추가합니다. 과잉 배양액을 제거합니다. 10% oxygen 및 5% CO2가 포함된 습윤한 분위기의 세포 배양기에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후, 배양액 1.5 milliliter를 천천히 첨가합니다. Medium CHE 식물체는 collagen 기질에 부착되어야 하며, 배양액의 50%를 매일 교체하십시오. 이제 시작하겠습니다.

이제 배양물을 살펴보겠습니다. 3~4일 이내에 운동성이 매우 높은 세포들이 ball checks에서 빠져나오게 됩니다. 이 세포들의 성상 형태와 세포 간 접촉이 주로 결핍되어 있다는 점에 주목하십시오.

다음 며칠 동안 더 많은 세포가 이주하고 이주한 세포들은 빠르게 증식하며, 표피 신경능보다 며칠 더 늦게 때때로 뚜렷해지는 편평한 형태의 중요한 희귀 세포들이 나타납니다. 이러한 배양액에서 줄기세포가 관찰되기도 합니다. 이 세포들은 표피 신경능 줄기세포가 아니라, 운동성이 더 낮은 추정 표피 줄기세포 또는 전구세포이며, 이러한 세포들로 구성된 배양액은 폐기해야 합니다.

표피 신경 줄기세포를 포함하는 벌지 이식 배양액을 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 신경 줄기세포는 이동성이 매우 강하므로, 3~4일 이내에 벌지 이식물에서 벗어나게 됩니다. 이식 후 벌지를 제거하면 배양 접시에는 순수한 신경 줄기세포 집단만 남게 됩니다.

이 절차를 수행할 때는 오염을 방지하기 위해 마우스를 주의 깊게 소독하는 것이 중요합니다. 또한 모낭에 손상을 주지 않도록 패드 위험 부위를 깊게 절개해야 합니다. 배양과 관련하여, 이동성 증류물, 신경능 세포 및 비이동성 자갈 모양의 각질형성세포를 구분하는 것이 중요합니다.

이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.