Name: 트레 Recombinase의 분자 진화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 배우세요 Tre recombinase의 분자 진화를 통해 HIV-1 프로바이러스를 특이적으로 절제하는 방법을. Cre recombinase를 기반으로 한 유도 진화 기법을 활용하여 감염된 인간 세포에서 바이러스를 제거하는 분자 수술 도구를 개발합니다.

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저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

트레 recombinase의 분자 진화

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

여기 우리는 감독, 분자 진화를 통해 트레 recombinase의 생성을보고. 트레 recombinase는 감염된 인간의 세포에서 provirus의 절단 및 박멸 그 결과, HIV - 1 provirus의 LTR 시퀀스 내에서 미리 정의된 대상 시퀀스를 인식합니다. 우리는 Cre 호텔, loxP로 알려진 34 - BP 더블 좌초된 DNA 시퀀스를 인식 38 KDA의 recombinase와 시작했다. Cre 호텔 효과적으로 게놈 시퀀스를 없앨 수 있기 때문에, 우리는 맞게하기 위해 통합 HIV - 1 provirus의 5&#39; - LTR과 3&#39; - LTR 사이의 순서를 제거할 수있는 recombinase를 설정합니다. 첫 단계로서 우리는 loxP 재조합과 유사하고 활동에 대한 검사를했던 LTR 사이트 내에서 시퀀스를 식별. 처음 Cre 호텔 및 mutagenized Cre 호텔 라이브러리는 HIV - 1 provirus의 선택 loxLTR 사이트를 재결합에 실패했습니다. 어떤 감독 분자 진화 과정의 시작은 적어도 잔류 활동을 필요로 원래의 비대칭 loxLTR 시퀀스는 하위 집합으로 분할 및 재조합 활동을 위해 다시 테스트되었습니다. 중간체 역할, 재조합 활동은 하위 집합으로 표시되었다. 다음 recombinase 라이브러리 되풀이하는 진화 사이클을 통해 풍부하게되었습니다. 이후, 풍부한 라이브러리가 단행하고 recombined했다. 다른 변이의 조합 시너지 입증하고 recombinases는 그 loxLTR1 및 loxLTR2를 재결합하는 수있었습니다 만들어졌습니다. 이 중간체를 통해 진화 전략은 성공할 수있다는 증거했습니다. 126 진화 사이클 총 후에 개인 recombinases은 기능과 구조적으로 분석했다. 가장 활성화된 recombinase - 트레은 - Cre 호텔에 비해 19 아미노산을 변경했다. 트레 recombinase는 소비세 게놈 HIV - 1 감염 헬라 세포 (참조 &quot;진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1 Proviral의 DNA 절단&quot;Hauber J., 실험 바이러스학 및 면역학에 대한 하인리히 - Pette - 연구소에서 HIV - 1 provirus을 수있었습니다 함부르크, 독일). 아직 초기에있는 동안, 감독 분자 진화는 &quot;분자 수술&quot;과 분자 의학의 도구가 될 것입니다 정의 효소의 생성을 허용합니다.

여기 우리는 감독, 분자 진화를 통해 트레 recombinase의 생성을보고. 트레 recombinase는 감염된 인간의 세포에서 provirus의 절단 및 박멸 그 결과, HIV - 1 provirus의 LTR 시퀀스 내에서 미리 정의된 대상 시퀀스를 인식합니다. 아직 초기에있는 동안, 감독 분자 진화는 분자 수술과 분자 의학의 도구가 될 것입니다 정의 효소의 생성을 허용합니다.

트레 Recombinase의 분자 진화

본 논문에서는 유도 진화(directed evolution)를 통한 Tre 재조합효소(recombinase)의 생성을 보고합니다. Tre 재조합효소는 ... 내의 미리 정의된 표적 서열을 인식합니다.

제 이름은 Frank Alz입니다. 저는 드레스덴에 위치한 Maxx Plunk Institute for Macular Cell Biology and Genetics의 그룹 리더입니다. 지금부터 분자 수술을 위한 부위 특이적 재조합 효소를 개발하기 위한 저희의 연구에 대해 말씀드리겠습니다.기본적으로 게놈에서 미리 정의된 서열을 절제할 수 있는 도구로서, 더 구체적으로는 바이러스로부터 HIV 감염 세포를 제거하려는 것입니다. 즉, 감염된 세포의 게놈에서 HIV 프로바이러스를 절제하는 것입니다. 또 다른 개념은 이미 잘 확립된 유전자 도구인 Cre Recombinase를 맞춤화하여, 우리가 미리 정의한 표적 부위를 결합하고 인식하며 활용하는 것입니다.따라서 우리는 HIV 바이러스의 LTR에 자연적으로 존재하는 부위에 결합하는 부위 특이적 재조합효소를 만들 수 있을지 확인하고자 했습니다. 만약 그것이 가능하다면, 게놈에서 프로바이러스를 절제하는 것 또한 가능할 것이라고 예측했습니다. 기본적으로 바이러스의 생애 주기는 바이러스가 세포 내로 통합되는 단계를 거치며, 역전사를 통해 두 개의 말단 반복 서열로 둘러싸인 DNA 템플릿을 생성하게 됩니다.이들은 긴 말단 반복 서열 또는 짧게 LTR이라고 불립니다. 그리고 이것이 핵 내부로 이동하여 숙주 게놈의 게놈 내에 거의 무작위로 통합됩니다. 따라서 이제 통합되어 두 개의 긴 말단 반복 서열, 즉 두 개의 LTR에 의해 측면이 둘러싸인 소위 프로바이러스 상태가 됩니다.현재의 개념은 만약 우리가 LTR에 존재하는 서열을 인식하는 재조합효소를 만들 수 있다면, 숙주 게놈으로부터 프로바이러스를 고리 형태로 절제하여 세포에서 바이러스를 제거할 수 있을 것이라는 점이었습니다. 그것이 개념적인 아이디어였습니다. 사실 재조합효소는 DNA 결합 단백질이며 매우 특정한 부위를 찾아냅니다.따라서 이 효소는 DNA 내의 특정 서열을 인식하는 DNA 결합 도메인을 가지고 있습니다. 이 정확한 서열을 찾았을 때에만 효소가 활성화되며, 그 외의 다른 서열에서는 활성화되지 않습니다.분자 진화의 원리는 기본적으로 누구나 알고 있는 내용인데, 이는 육종과 다름없기 때문입니다. 분자 진화의 원리는 돌연변이를 도입한 다음 선택 과정을 거쳐 특정 특성을 선택하는 것입니다. 이는 식물 육종을 수행할 때와 동일합니다.특정 크기나 특정 색상과 같은 원하는 형질이 있다면, 다음 세대 자손 중에서 해당 특징을 가진 개체들을 계속해서 선택하여 서로 교배시킵니다. 이는 우리가 분자를 다룰 때 하는 방식과 정확히 동일합니다. 즉, 기본적으로 모든 과정이 동일하지만 그 규모만 작은 것입니다.먼저 특정 활성을 가진 효소(본 사례에서는 CRE recombinase)와 야생형 단백질로 시작합니다. 그 다음 이 recombinase가 결합하는 부위를 약간 변이시키면, 활성이 매우 낮아지게 됩니다. 그런 다음 recombinase 효소에 무작위 변이를 도입하고, 변이된 부위에 결합할 수 있게 된 돌연변이체들을 선별합니다.이를 확보하면, 서로 다른 돌연변이체들을 결합하여 최종적으로 우리가 원하는 최종 산물을 얻을 수 있으며, 이를 통해 리콤비나제가 LTR에서 정의한 서열을 인식하도록 할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이, 우리는 무작위 돌연변이 라이브러리로 시작합니다. 이는 일반적으로 에러 유발 PCR(error prone PCR)을 통해 수행됩니다.따라서 우리는 PCR 조건을 사용하는데, 예를 들어 Taq polymerase의 경우 많은 오류를 범합니다. 이런 방식으로 우리는 곳곳에 돌연변이가 포함된 무작위 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 또한 특정 전사체에 많은 돌연변이를 유도하는 박테리아 돌연변이 유발 균주(mutator strain)를 사용할 수도 있습니다.그런 다음 이것들을 시작 물질로 사용합니다. 저희가 사용하는 또 다른 기술은 일정 시간이 지난 후 DNA 셔플링을 이용하는 것입니다. 이는 기본적으로 서로 다른 유익한 돌연변이들을 결합할 수 있게 해주는 기술입니다. 어떤 돌연변이가 유익한지 정확히 알 수는 없지만, 서로 다른 돌연변이를 가진 다양한 변이체들을 확보하게 되기 때문입니다.여기에 유익한 돌연변이가 있는 하나의 유전자가 있습니다. 그리고 다른 위치에 돌연변이가 있는 두 번째 클론이 있습니다. 이 두 가지를 하나로 합치기 위해, 먼저 서로 다른 조각들을 무작위로 단편화한 다음, PCR 반응을 통해 이들을 다시 결합하여 산물을 재구성합니다. 그러면 특정 빈도로 돌연변이의 일부는 첫 번째 돌연변이에서, 나머지 일부는 두 번째 돌연변이에서 유래한 두 돌연변이의 조합이 형성될 것입니다.그리고 여기에 있는 이 부분은 추가적인 효과를 가지게 되어, 원하는 특성을 가진 후보군을 훨씬 더 빠르게 선택할 수 있게 해줄 것입니다. 따라서 저는 야생형 단백질이 특정 부위에서 전혀 활성을 나타내지 않는다는 정의를 설정하겠습니다. 예를 들어, HIV-LTR에서 선택한 우리의 서열을 사용하여 cre recombinase를 처리하면, 전혀 활성이 나타나지 않을 것입니다.CRE 재조합효소는 해당 부위를 재조합할 수 없으며, 정의상 이 서열에 결합하여 재조합할 수 있는 효소를 얻게 되었을 때 새로운 재조합효소를 갖게 되었다고 할 수 있습니다. 수행할 사이클 횟수를 미리 정하지는 않았지만, 우리가 원하는 활성을 가진 효소를 얻을 때까지 필요한 만큼의 사이클을 수행했습니다. 처음에는 부위에 매우 미세한 돌연변이들을 도입한 다음, 서로 다른 돌연변이들을 결합하기 시작했습니다.이 단계는 이 공정이 작동하는 이유를 설명하는 중요한 단계 중 하나였습니다. 따라서 우리는 중간체들을 거쳤으며, 다음 단계로 넘어갈 만큼 충분한 활성을 가진 효소를 찾기 위해 이처럼 많은 사이클을 수행해야 했습니다. 이는 일반적인 육종 과정과 매우 유사합니다.원하는 특정 활성과 특정 형질을 설정한 다음 육종을 시작합니다. 원하는 결과를 얻을 때까지는 목표에 도달한 것이 아니므로 더 많은 세대를 거쳐야 합니다. 기본적으로 이러한 방식으로 진행됩니다.또한 120회의 진화 사이클, 정확히는 128회를 거쳤는데, 이는 어느 정도의 활성이 나타나서 이제 멈춰도 되겠다고 판단되는 중간 단계를 찾기 위함이었습니다. 현재 우리가 확보한 재조합 효소는 야생형 CRE recombinase보다 여전히 활성이 낮습니다. 따라서 더 높은 활성을 가진 재조합 효소를 얻기 위해서는 더 많은 진화 사이클을 수행해야 할 것입니다.따라서 진화 과정에 있어 현재 우리가 도달한 지점에서 기본적으로 끝나는 것은 아닙니다. 기술적인 한계는 보이지 않지만, 이를 어디까지 밀어붙일 수 있을지는 의문입니다.따라서 LTR 측의 locks의 경우, LTR HA에서 발견되는 서열은 query 리콤비나제가 인식하는 천연 locks P 측, 즉 천연 사이트와 50%의 서열 유사성을 공유합니다. 여기서 질문은 더 나아가 가능할 것인가 하는 점인데, 아직 이는 알지 못하지만, 야생형 사이트와 단 50%의 서열 유사성만 가졌음에도 작동했다는 사실은 이를 더욱 확장할 수 있음을 시사합니다. 앞서 언급했듯이 query 리콤비나제가 자신의 고유 사이트에서만큼 활발하지는 않더라도, 이 리콤비나제는 인간 조직 배양 세포에서 잘 작동합니다.따라서 안정성은 아마도 질의 리콤비나제(recombinase), 즉 야생형 효소보다 다소 낮을 것이며, 향후 이러한 특성을 개선하기 위해서는 더 많은 선별과 더 많은 진화 주기가 필요할 것입니다. 그러므로 첫 번째 단계는 이 특정 리콤비나제인 3-리콤비나제의 부위를 개선하여 활성을 높이는 것이며, LTR에서 좋은 표적이 될 수 있는 다른 두드러진 부위들을 찾아 이에 적합한 우수한 리콤비나제를 찾는 것입니다. 그 다음으로 이 리콤비나제를 다양한 분석법으로 테스트해야 하며, 우선 다시 한번 조직 배양 세포에서 테스트하고, 이후 매우 중요하게는 동물 모델에서 이 리콤비나제를 테스트해야 합니다.따라서 이 리콤비나아제가 생체 내에서 바람직하지 않은 부작용을 일으키는지 확인해야 합니다. 그리고 물론, 이 리콤비나아제를 위한 효율적인 전달 시스템을 개발하는 것이 매우 까다로운 과제이며 이는 결코 간단한 일이 아닙니다. 이는 그 자체로 하나의 방대한 연구 분야이기도 합니다.그것은 기본적으로 우리가 취해야 할 유전자 치료 접근 방식이었습니다. 의료 분야가 점점 더 분자 수준으로 이동하고 있다고 생각합니다. 그리고 이를 위해서는 당연히 그러한 규모에서 작업할 수 있는 도구가 필요합니다.그리고 이것이 제가 생각하는 진화 과정의 미래입니다. 따라서 우리는 우리가 실제로 사용하고자 하는 프로세스에서 작동하는 맞춤형 효소를 만들어야 합니다. 리콤비나제(recombinase)의 경우, 이를 수술 중에 특정 부위를 절제해야 하는 외과 의사의 도구에 비유할 수 있을 것입니다. 즉, 이제는 분자 외과 의사가 게놈에서 특정 DNA 조각을 정밀하게 절제하고자 할 때 필요한 도구가 필요합니다.이를 위해 그는 이를 수행할 수 있는 도구가 필요합니다. 따라서 분자 진화가 기본적으로 이러한 기능을 충족할 수 있습니다. 자연계에는 이러한 작업을 수행하는 데 매우 바람직한 특성을 가진 많은 효소들이 존재합니다.우리는 이를 유용하게 만들기 위해 우리의 필요에 맞게 제작해야 합니다. 저는 분자 진화가 여기서 매우 중요한 역할을 할 수 있다고 생각합니다. 이 분야의 기술이 아직 초기 단계에 있기 때문에, 현재로서는 한계점이 어디인지 단정적으로 말하기 어렵습니다.따라서 한계점이 어디에 있는지는 시간이 지나면 알게 될 것입니다. 어느 정도의 한계는 분명히 있겠지만, 현재로서는 한계보다는 기회가 더 많다고 생각합니다.

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인터뷰 : 진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1의 DNA 절단 Proviral

에서 상동 재조합 구문을 Recombineering<em&gt; 초파리</em

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Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

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