트레 Recombinase의 분자 진화

제 이름은 프랭크 알츠입니다. 저는 Maxx Plunk Institute for Macular Cell Biology and Genetics와 드레스덴의 그룹 리더입니다. 이제 분자 수술을 위한 부위 특이적 재조합효소를 개발하기 위한 우리의 작업에 대해 말씀드리겠습니다.

기본적으로 게놈에서 염기서열, 사전 정의된 염기서열을 절제할 수 있는 도구로서, 더 구체적으로 바이러스에서 HIV 감염 세포를 근절하려고 합니다. 따라서 기본적으로 감염된 세포의 게놈에서 HIV 프로바이러스를 제거하는 것입니다. 다른 개념은 우리가 이미 잘 확립 된 유전 도구, 즉 Cree Recombinase를 적용하여 우리가 미리 정의한 표적 부위를 결합하고 인식하고, 사용한다는 것입니다.

그래서 우리는 HIV 바이러스의 LTR에서 자연적으로 발생하는 부위에 결합하는 부위 특이적 재조합효소를 만들 수 있는지 말하기 시작했습니다. 그리고 만약 우리가 그렇게 할 수 있다면, 게놈에서 프로바이러스를 제거하는 것이 가능할 것이라고 예측할 수 있습니다. 기본적으로 바이러스의 수명 주기는 바이러스가 세포에 통합되고 역전사를 통해 DNA 주형을 만드는 단계를 거치며, 이 주형은 두 개의 말단 반복으로 둘러싸여 있습니다.

이를 긴 터미널 반복 또는 짧은 LTR이라고 합니다. 그런 다음 이것은 핵으로 가져와 실제로 숙주 게놈의 게놈에 다소 무작위로 통합됩니다. 이제 여러분은 소위 프로바이러스라고 불리는 바이러스가 있는 상황에 처해 있는데, 이 바이러스는 통합되어 있고 두 개의 LTR에 의해 두 개의 긴 말단 반복

이제 개념은 LT R에 존재하는 염기서열을 재조합화할 수 있다면 숙주 게놈에서 프로바이러스를 주기로 절제하여 세포에서 바이러스를 근절할 수 있어야 한다는 것이었습니다. 그것이 개념적 아이디어였습니다. 글쎄요, 재조합효소는 실제로 DNA 결합 단백질이며 매우 특이적인 부위를 찾습니다.

따라서 DNA 결합 도메인이 있어 DNA 내의 특정 염기서열을 인식합니다. 그리고 이 정확한 염기서열을 찾을 때에만 효소가 활성화됩니다. 다른 시퀀스에서는 활성화되지 않습니다.

분자 진화의 원리는 기본적으로 육종에 불과하기 때문에 누구에 의해, 누구에 의해 알려져 있습니다. 분자 진화의 원리는 돌연변이를 도입한 다음 선택 과정을 거쳐 특정 특성을 선택하는 것입니다. 식물 육종을 할 때와 같습니다.

당신은 당신이 확실한, 특정한 크기나 특정한 색깔을 원한다는 것을 알고 있고, 그런 다음 항상 특정한 특징을 가진 다음 세대의 자손을 위해 다시 취하고 그것들을 서로 번식시키기 시작합니다. 그것은 우리가 분자에 대해 하는 것과 정확히 동일합니다. 따라서 기본적으로 모든 것이 있지만 소규모입니다.

그래서 우리는 CRE 재조합효소(CRE recombinase)와 같은 특정 활성을 가진 효소로 시작하고, 그 다음에는 야생형 단백질로 시작합니다. 그런 다음 이 재조합효소가 결합하는 부위를 약간 돌연변이시키지만 여전히 활성이 매우 낮습니다. 그런 다음 효소와 재조합효소에 무작위 돌연변이를 도입하고 돌연변이를 선택하여 이 돌연변이된 부위에 결합할 수 있습니다.

일단 우리가 이것을 갖게 되면, 우리는 또한 다른 돌연변이를 함께 결합하여 최종적으로 우리가 원하는 궁극적인 산물에 도달하여 재조합효소가 LTR에서 정의한 염기서열을 인식할 수 있습니다. 그래서 우리는 제가 말했듯이 무작위 돌연변이 유발 라이브러리로 시작합니다. 이는 일반적으로 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의해 수행됩니다.

그래서 우리는 PCR 조건을 사용하는데, 예를 들어 턱 중합효소와 같은 경우 많은 실수를 저지르게 됩니다. 그리고 이런 식으로 우리는 돌연변이를 여기저기 운반하는 무작위 라이브러리를 생성합니다. 우리는 또한 박테리아 돌연변이 균주인 돌연변이 균주를 사용할 수 있는데, 이는 특정 전사체에 많은 돌연변이를 도입하도록 유도합니다.

그리고 이들은 출발 물질로 사용됩니다. 우리가 사용하는 또 다른 기술은 잠시 후 DNA 셔플링을 사용하는 것입니다. 그것은 기본적으로 어떤 돌연변이가 유익한지 실제로 알지 못하기 때문에 다른 유익한 돌연변이를 결합할 수 있는 기술이지만, 다른 돌연변이를 가진 다른 돌연변이를 갖게 될 것입니다.

그러니까 여기에 돌연변이가 있는 유전자가 하나 있는데, 이건 유익합니다. 여기에 돌연변이가 있는 두 번째 클론이 있으며, 이 두 클론을 결합하기 위해 이제 서로 다른 조각의 무작위 단편화를 수행한 다음 PCR 반응으로 이를 결합하여 산물을 재조립합니다. 그리고 이제 여러분은 특정 빈도에서 이 둘의 조합을 갖게 될 것인데, 여기서 재조합의 일부는 이 돌연변이로부터 만들어지고 일부는 이 돌연변이로 만들어집니다.

그리고 여기 이 사람은 개선될 추가 효과를 갖게 될 것이며, 원하는 속성을 가진 후보를 훨씬 더 빨리 선택할 수 있을 것입니다. 그래서 저는 야생형 단백질이 특정 부위에서 전혀 활동하지 않는다고 말하는 곳에 정의를 설정할 것입니다. 예를 들어, H-I-V-L-T-R에서 LTR에서 선택한 염기서열을 취하면 염기서열에서 cre recombinase를 시도하면 전혀 활성이 없습니다.

CRE 재조합효소는 부위를 재조합할 수 없으며 정의에 따라 새로운 재조합효소를 갖게 되며, 이 서열을 결합하고 재조합할 수 있는 효소가 있을 때 말하겠습니다. 우리는 얼마나 많은 사이클을 할 것인지 미리 정의하지 않았지만, 우리가 원하는 활성을 가진 효소를 가질 때까지 필요한 만큼의 사이클을 수행했습니다. 그래서 우리는 현장에서 아주 작은 돌연변이부터 시작해서 서로 다른 돌연변이를 결합하기 시작했습니다.

이것은 이 프로세스가 작동하는 이유의 중요한 단계 중 하나였습니다. 그래서 우리는 중간체를 거쳤고 효소를 찾기 위해 이렇게 많은 주기를 거쳐야 했고, 그 효소는 다음 주기로 갈 수 있을 만큼 충분히 활동적입니다. 그것은 모든 번식 과정과 매우 유사합니다.

원하는 특정 활동, 원하는 특정 기능을 설정한 다음 번식을 시작합니다. 그리고 당신이 원하는 것을 가질 때까지, 당신은 거기에 있지 않고 더 많은 세대를 살아야 합니다. 그것이 기본적으로 있는 곳입니다.

저는 또한 120개의 진화 주기 또는 정확히 말하자면 1286개의 진화 주기, 우리가 말한 중간 단계를 찾기 위해, 그래서 이제 우리는 어떤 활동이 있기 때문에 멈출 수 있다고 말해야 합니다. 우리가 지금 가지고 있는 재조합은 야생형 측면에서 CRE 재조합효소보다 여전히 덜 활동적입니다. 따라서 더 활발한 재조합효소를 얻기 위해서는 더 많은 진화 주기를 수행해야 합니다.

그래서 그것은 기본적으로 끝나지 않습니다: 진화 과정을 위해 우리가 지금 어디에 있는지. 기술적 제한 사항이 보이지 않습니다. 이것을 어디까지 밀어붙일 수 있는지는 의문입니다.

따라서 잠금 LTR 측, 따라서 LTR HA에서 찾은 시퀀스는 경력 재조합이 인식하는 자연 잠금 P 측과 50% 시퀀스 유사성을 공유합니다. 그래서 문제는 하나의 목표를 더 멀리 갈 수 있다는 것이고 우리는 아직 이것을 알지 못하지만 fif 만 가지고 있다는 사실은 와일드 타입 사이트와 50 % 시퀀스 유사성을 가지며 이것을 더 멀리 밀어 붙일 수 있음을 시사합니다. 재조합효소는 인간 조직 배양 세포에서 잘 작동하지만, 제가 말했듯이 쿼리 재조합효소만큼 활동적이지는 않습니다.

따라서 아마도 안정성은 쿼리 재조합 효소보다 다소 낮을 수 있으며, 야생형 효소는 더 많은 선택이 필요하고 더 많은 진화 주기가 필요할 것입니다. 그래서 첫 번째 단계는 이 부위를 개선하고, 이 특정 재조합효소, 세 가지 재조합효소를 더 활성화하고, 어쩌면 LTR에서 좋은 표적이 될 수 있는 매우 눈에 띄는 부위인 다른 부위를 찾고, 이에 대한 매우 좋은 재조합효소를 찾는 것입니다. 그런 다음 먼저 조직 배양 세포에서 다른 분석법으로 이 재조합효소를 테스트해야 하지만, 그 다음에는 동물 모델에서 이 재조합효소를 테스트하는 것이 매우 중요합니다.

따라서 우리는 이 재조합효소가 유기체에 바람직하지 않은 부작용이 있는지 확인해야 합니다. 그리고 물론, 매우 어려운 측면은 이 재조합효소를 위한 좋은 전달 시스템을 개발하는 것인데, 이는 사소한 일이 아닙니다. 그리고 그 자체로 개발해야 할 전체 연구 영역입니다.

그것은 기본적으로 우리가 취해야 할 유전자 치료 접근법이었습니다. 글쎄요, 저는 의학이 점점 더 분자화되는 변화를 보고 있다고 생각합니다. 그리고 이를 위해서는 물론 이러한 규모로 작업할 수 있는 도구가 필요합니다.

그리고 이것이 바로 제가 진화 과정의 미래가 어디에 있는지 보는 곳입니다. 그래서 우리는 재조합효소의 경우에 우리가 정말로 사용할 수 있기를 바라는 과정에 작용하는 맞춤형 효소를 만들어야 하며, 어쩌면 이것을 수술 중 절제가 필요한 외과 의사를 위한 도구에 비유할 수 있을 것입니다. 그래서 우리는 분자 외과 의사가 기본적으로 게놈에서 특정 DNA 조각을 구체적으로 절제하기를 원하는 도구가 필요합니다.

그리고 이를 위해 그는 이것을 할 수 있는 도구가 필요합니다. 그래서 분자 진화는 기본적으로 이 기능을 수행할 수 있습니다. 많은 효소가 자연계에 존재하며, 이러한 효소는 이를 수행할 수 있는 매우 바람직한 특성을 가지고 있습니다.

그리고 우리는 그것들을 우리가 필요로 하는 것에 맞추어야만 그것들을 유용하게 만들 수 있습니다. 그리고 저는 분자 진화가 여기에서 매우 중요한 역할을 할 수 있다고 생각합니다. 한계가 어디인지는 현재로서는 말하기 어려운데, 그 이유는 이 기술, 이 분야가 아직 초기 단계이기 때문입니다.

따라서 한계가 어디에 있는지는 시간이 말해 줄 것입니다. 분명 어느 정도 있을 거라고 생각하지만, 현재로서는 한계보다 기회가 더 많다고 생각합니다.