Name: 인터뷰 : 진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1의 DNA 절단 Proviral (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 배우세요 HIV-1 감염 세포에서 통합된 프로바이러스 DNA를 절단하는 엔지니어링된 리콤비나제 방법을. 이 연구는 바이러스 저장소 제거를 통한 기능적 치료 가능성을 보여줍니다.

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저자들은 공개할 사항이 없습니다.

인터뷰 : 진화 recombinase을 사용하여 hiv - 1의 dna 절단 proviral

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV - 1 감염 세포의 호스트 염색체에 통합과 긴 터미널 반복 둘러싸인 provirus로 지속. 현재 치료 전략은 주로 감염을 근절하지 않고 바이러스 효소 또는 바이러스 - 세포 융합, 억제 바이러스 생활주기를 대상으로. 통합 provirus가 이러한 방식을, HIV - 1의 새로운 내성 변종의 대상이 아니므로 등장 수도 있습니다. 여기서 우리는 설계 recombinase 트레가 (트레 recombinase, 뷰큘츠, F., 세포 생물학 및 유전학에 대한 최대 플랑크 연구소, 드레스덴의 분자 진화를 참조) 효율적으로 감염 세포의 게놈에서 통합 HIV - 1 proviral DNA를 excises 것을보고합니다. 우리는 바이러스 검사 및 감염 pseudotypes 헬라 세포를 포함하는 loxLTR을 생산 트레 recombinase는 HIV - 1 감염 인간 세포의 게놈에서 소비세 provirus 수 있는지 여부. 바이러스 입자 - 방출 셀 라인은 복제와 플라스미드 표현 트레 또는 보호자 제어 벡터와 transfected했다. Recombinase 활동 및 바이러스 생산을 감시했다. 모든 assays 보이는 세포 독성 효과없이 감염된 세포에서 provirus의 효율적인 삭제를 보여주었다. 이러한 결과는 특히 HIV - 1 LTR를 대상으로 recombinase를 발전 가능이 recombinase는 HIV - 1에 감염된 인간 세포의 게놈에서 HIV - 1 provirus을 절개 수있다는 것을 원칙의 증거로 제공하고 있습니다. 설계 recombinase가 치료 올라와있을 전에 그러나, 큰 장애물은 극복해야합니다. 가장 중요한 문제 중 우리가 얼굴 즉, 타겟 세포에 효율적이고 안전하게 전달 및 부작용의 부재입니다.

현재 HIV - 1 전략은 바이러스 생활주기를 억제하지만, 효과적으로 감염을 근절하지 행동. 여기, 우리는 입증되는 감염된 세포의 게놈에서 설계 recombinase 수 효율적으로 소비세 통합 HIV - 1 proviral DNA.

인터뷰 : 진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1의 DNA 절단 Proviral

HIV-1은 감염된 세포의 숙주 염색체에 통합되며, 양 끝단에 긴 말단 반복 서열(long terminal repeats)이 위치한 프로바이러스(provirus) 형태로 지속됩니다. 현재의 치료 전략은...

저는 독일 함부르크에 위치한 HE Pet Institute의 세포생물학 및 생물학부 책임자인 JohE Hvar입니다. HE PET Institute는 인간의 pe, 병원성 바이러스 및 이와 관련된 문제들을 전담으로 연구하는 기초 연구 기관입니다. 저희 학과는 주로 HIV 유전자 발현의 조절과 특히 HIV가 숙주 세포의 구성 요소와 맺는 세포 내 상호작용을 조사하는 데 관심을 두고 있습니다.이러한 데이터를 기반으로, 우리는 또한 HIV 질환에 대한 새롭고 실험적인 치료법을 개발하고자 노력하고 있습니다. HIV의 문제는 HIV가 레트로바이러스 또는 렌티바이러스라는 점이며, 모든 레트로바이러스와 마찬가지로 HIV는 숙주 세포에 감염될 때 바이러스 게놈을 숙주 세포 게놈에 통합시킨다는 것입니다. 현재까지는 이렇게 통합된 프로바이러스를 더 이상 제거할 수 없습니다.이는 치료 관점에서 볼 때, 평생 치료가 필요한 만성 질환이며 약물의 부작용, 내성 발생 등 평생 치료와 관련된 모든 문제들이 수반됨을 의미합니다. 한편, 기초 연구 분야에서는 수년 전부터 효모나 박테리아 등에서 자연적으로 발생하는 소위 재조합효소(recombinase)에 대해 알고 있었습니다. 이러한 재조합효소들은 특정 DNA 서열을 인식하여 유전자를 섞거나 게놈을 재배열하는 등의 역할을 합니다.특히 Cre 재조합 효소라고 불리는 재조합 효소가 기초 연구 및 in situ 연구에 사용됩니다. Cre는 기본적으로 자신의 특정 서열을 인식하며, 두 개의 인식 부위 사이에 서열이 위치한 경우 Cre는 기본적으로 그 사이의 서열을 절제할 수 있습니다.따라서 10년 또는 15년 전부터 제기된 아이디어는 의학적으로 바이러스를 박멸하는 것이며, 다른 한편으로는 Cre와 같은 재조합 효소(recombinase)를 사용하여 프로바이러스 DNA를 절단하는 것입니다. 이론적으로 이것은 가능해야 하는데, 왜냐하면 HIV는 감염 시 자신의 RNA 게놈을 DNA로 역전사하며, 이 역전사 과정으로 인해 LTR(long terminal repeats)이라고 불리는 서열이 생성되어 통합된 프로바이러스 DNA의 5' 말단(시작점)과 3' 말단(끝점)을 기본적으로 표시하기 때문입니다. 따라서 만약 LTR 내의 특정 서열을 구체적으로 인식하는 재조합 효소를 개발할 수 있다면, Cre는 통합된 프로바이러스 DNA의 5' 말단과 3' 말단을 공격하여 DNA를 절단하고, 결과적으로 감염된 세포에서 바이러스를 박멸할 수 있을 것입니다. 현재 HIV의 문제는 서로 다른 분리주(isolates)가 존재하며, 심지어 단일 환자 내에서도 그럴 수 있다는 점이지만, 지금까지 알려진 바에 따르면 바이러스 게놈의 시작과 끝부분의 서열은 보존되어 있습니다.다시 말해, LTR은 예를 들어 HIV 유전자보다 더 잘 보존되어 있습니다. 따라서 소수의 재조합체만으로도 모든 HIV 분리주의 광범위한 다양성을 기본적으로 인식할 수 있을 가능성이 높다고 생각합니다. 만약 그렇지 않다면, 기본적으로 분자 진화를 통해 새로운 재조합체를 생성해야 하며, 이는 향후 반자동화될 수 있습니다.또한 이 과정은 실험실에서 직접 수행하는 것보다 훨씬 더 빠를 것입니다. 저희 동료인 Max Planck Institute의 Dr. Frank가 이 과정에 참여하게 되었습니다. 기본적으로 그는 리콤비나제(recombinase) 및 관련 분야의 전문가입니다.기본적으로 그가 사용한 것은 소위 분자 진화 방법이라고 불리는 것입니다. 하지만 이 방법은 PCR(중합효소 연쇄 반응) 기술을 기반으로 합니다. 그는 천연 재조합효소인 Cre recombinase의 유전자를 추출하여, 무작위로 돌연변이가 도입되는 조건에서 PCR 또는 다중 PCR 반응을 수행합니다.이제 핵심은 HIV 특이적 서열을 인식하는 새로운 능력이나 활성을 획득한 재조합효소의 새로운 버전들을 선택하는 것입니다. 그리고 그는 이를 반복적인 사이클로 수행하고 있습니다. 이러한 유형의 분자 진화 방법을 수행하는 데 약 120회 또는 120회 이상의 사이클이 소요되었습니다.그가 마침내 HIV 서열을 특이적으로 인식하는 새로운 재조합 효소인, 현재 LTR 특이적 재조합을 위한 3-LTR이라 불리는 것을 개발했을 때의 일입니다. 초기 연구의 경우, 재조합 효소를 이용한 실험들이 이곳 함부르크의 HE PET 연구소에서 수행되었습니다. 저희가 수행한 작업은 특히 이 재조합 효소를 유전자 벡터에 담아, 임상 분리주에 가까운 HIV-1에 감염된 인간 세포 배양물에 전달한 것이었습니다.그리고 6주에서 8주에 걸쳐 시간이 흐르면서, 우리는 이를 입증할 수 있었습니다. 현재 재조합체는 정량적으로 매우 흥미로운데, 이들이 HIV profile DA를 통합함으로써 기본적으로 전체 배양물이 HIV가 제거되어 완치되었습니다. 물론 이 기술에는 분명히 수많은 문제점이 존재합니다.먼저, 리콤비나제(recombinase)의 발현이 독성 부작용을 일으키지 않는지 확인해야 합니다. gre와 같은 자연 발생 재조합의 경우, 소위 형질전환 동물이 이미 존재하므로 이러한 부작용은 예상되지 않습니다. 이러한 GRE 재조합이 발현되며, 일부 문제가 있기는 하지만 그리 심각하지는 않습니다.현 시점에서는 그렇게 말씀드릴 수 있을 것 같습니다. 따라서 독성 부작용이 없을 것이라는 희망이 있지만, 실제로 실험을 수행해 보기 전까지는 알 수 없습니다. 또한 모든 임상 분리주를 인식하지 못할 수도 있다는 문제가 있으며, 이로 인해 환자 내의 우세한 HIV 분리주를 완전히 제거하지 못할 가능성이 있습니다.하지만 시간이 지나면서 소수의 분리주 중에서 선택하게 될 것입니다. 이는 우리가 알 수 없으므로, 이러한 실험들을 수행해야 합니다. 그다음에는 유전자 전달과 벡터 기술과 관련된 큰 문제가 있습니다.유전자 또는 재조합 효소 유전자를 전달하기 위해 소위 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 사용해야 합니다. 그렇다면 부작용이 있을까요? 이러한 벡터들이 독성 효과를 일으키나요?저희가 가진 질문은 이것이 전부입니다. 또한, 콤(comb)의 활성을 개선하고자 합니다. 재조합이 현재 수 주 동안 관찰된 것보다 더 빠르게 작용하고 있습니다.따라서 이것들은 모두 우리가 향후 몇 년 동안 해결해야 할 과제들입니다. 그리고 리콤비나제(recombinase)는 경구 투여가 불가능하기 때문에 이것이 현재 분명한 문제입니다. 즉, 단순히 알약 형태의 리콤비나제 약을 복용하여 바이러스를 제거하는 방식은 불가능할 것입니다.따라서 향후 치료법에 대해 추측해 보자면, 유전자 치료 접근법을 고려해야 합니다. 예를 들어, HIV 감염 환자의 혈액에서 소위 조혈모세포 또는 CD 34 양성 세포를 분리하는 방법을 생각할 수 있습니다. 그 다음 실험실에서 이 환자 세포에 CCR5 유전자를 도입하는 것입니다.마지막으로, 유전적으로 변형된 환자의 세포를 동일한 환자의 체내로 다시 주입합니다. 그렇게 되면 시간이 지남에 따라 환자의 면역 체계 또는 조혈 체계가 최소한 부분적으로는 재구성되어, HIV에 감염되었을 때 재조합 효소(recombinase)를 발현함으로써 바이러스를 제거할 수 있는 세포들로 채워지게 됩니다. 결과적으로 환자의 바이러스 수치가 감소하며, 이는 분명히 삶의 질을 향상시킬 것입니다.또한 우리는 이 환자들의 면역 체계가 최소한 부분적으로라도 다시 재구성되기를 기대할 수 있습니다. 따라서 이제 완전히 기능하는 면역 세포들이 이 환자들에게 남아 있는 잠복 감염 세포들을 공격할 수 있기를 바랍니다. 우리가 환자로부터 HIV를 정말로 완전히, 전적으로 제거할 수 있을지 없을지는 현재로서는 알 수 없습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 감독, 분자 진화를 통해 트레 recombinase의 생성을보고. 트레 recombinase는 감염된 인간의 세포에서 provirus의 절단 및 박멸 그 결과, HIV - 1 provirus의 LTR 시퀀스 내에서 미리 정의된 대상 시퀀스를 인식합니다. 아직 초기에있는 동안, 감독 분자 진화는 분자 수술과 분자 의학의 도구가 될 것입니다 정의 효소의 생성을 허용합니다.

트레 Recombinase의 분자 진화

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

거의 동종발생 바이러스 간의 성장 경쟁은 상대적 복제 적합성을 결정하기 위한 민감한 측정을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 재조합 HIV-1 클론의 구축, 바이러스 전파 및 성장 경쟁, 민감하고 일관된 결과를 산출하도록 최적화된 분석 방법이 포함됩니다.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

배우세요 HIV-1 감염 세포에서 통합된 프로바이러스 DNA를 절단하는 엔지니어링된 리콤비나제 방법을. 이 연구는 바이러스 저장소 제거를 통한 기능적 치료 가능성을 보여줍니다.

인터뷰 : 진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1의 DNA 절단 Proviral

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