Name: 공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 학습하세요 마우스 배아 줄기세포의 체외 분화를 공중 드롭 방법으로 유도하는 기술을. 이 방법은 배아체 형성과 재생의학 연구에 활용됩니다.

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<ol><li> 전에 37 ° C, 5 % CO 2 조직 문화의 인큐베이터 하룻밤 하루에 0.1 % 젤라틴 용액과 부화 플레이트를 사용하여 T75 휴대용 술병을 아교 질로 만들다. </li><li> , 품어에서 MES의 세포를 꺼내서 매체를 대기음, PBS와 ES 세포 문화를 린스, 요리의 코트 바닥 (2 ml/100mm 판)에 0.05 %의 트립신 솔루션을 추가합니다. </li><li> 세포가 접시를 sloughing 때까지, 37 ° C 약 1 분 동안 품어. </li><li> 부드럽게 (pipet 위, 아래) 4-6 번 연결 파스퇴르 피펫으로 ES 세포를 분산하기 위해 trypsinized 세포, 씹다. prewarmed을 (37 ° C) MES 매체가 포함된 15 ML 원뿔 원심 튜브에 분산 ES 세포를 전송합니다. </li><li> 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는을 기음, MES 매체 10 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 형성하고 아래로 피펫. </li><li> 37 0.1 % 젤라틴과 부화로 사전 코팅 T75 플라스크에 세포 현탁액을 전송 ° C 한 시간 만이라도 5 % CO 2 * 일시간 후, 섬유아 세포는 판에 부착된했지만 줄기 세포는 매체에 남아 있습니다. 줄기 세포를 수집하는 매체를 피펫. </li><li> 5 분 1,000 RPM에서 세포를 분사하고 MES 미디어를 대기음. 다음 MES 차별 매체의 또 다른 10 ML을 추가하고 세포의 벌금 정지있을 나타날 때까지 반복적인 pipetting하여 세포를 resuspend. </li><li> 멸균 분지 20ul (20ul/drop) 당 400-500 세포의 농도에 줄기 세포 현탁액을 희석하기 위해 hemocytometer 사용 차별화 매체와 세포를 계산합니다. </li><li> 뚜껑을 리프트, 조심스럽게 그것을 반전하고 PBS 10 ML 들어있는 접시 위에 놓으십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 조직 문화 요리의 뚜껑의 최대 - 설정되어 안쪽 표면에 20ul 방울의 행을 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 2 일 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 이틀 뒤에는, 신중하게, 슬라이딩 커버를 뒤집 180 UL 신선한 차별 미디어를 기음과 96 잘 ultralow 부착 판의 우물에 몇 방울을 넣어. 다음 피펫과 전송 방울, 일대일하여 96 - 웰 플레이트까지 픽업 드롭합니다. 3 일간 그대로 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 문장의 각 우물의 젤라틴 0.1 %의 300ul와 48 - 잘 조직 배양 플레이트. 젤라틴을 추가 후, 37시 야간 번호판을 품어 ° C 하루 앞서 전 EBS를 전송합니다. </li><li> 다음날 48 아니라 판에서 젤라틴을 대기음. 다음 각 잘하는 차별화 매체 300 UL를 추가합니다. 48 잘 젤라틴 - 코팅 접시 하나별로 하나에 96 잘 접시에서 EBS를 전송합니다. 다음날 매체를 변경 후 세포를 유지하기 위해 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 자연 cardiaomyocyte 수축이 7 일 이내 분명해야합니다. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

한 방울의 액체 볼륨으로 인해 표면 장력에 의해 뚜껑에 매달려 방울을 유지하기 위해보다 50ul에 국한되며, 그것은 방울을 매달리기 매체를 변경 불가능 : 매달려 드롭 방식의 단점은 다음과 같다. 직접 현미경과 방울에 EBS를 형성의 관찰 재배 기간도 매우 어렵습니다. 또한 더 매달려 드롭 방법은 두 단계로 구성되어 있으므로, 매달려 드롭 방식의 단계는 일련의은 골칫거리 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>시약</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicllin / Streptomycin</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>시약</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자(LIF)</td><td>시약</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>96-well 초저부착 플레이트</td><td>도구</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (mes) 세포의 체외 차별에

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

줄기 세포는 다양한 세포 유형으로 개발하는 놀라운 잠재력을했습니다. 줄기 세포가 분할되면, 각각의 새로운 세포 중 줄기 세포 유지하거나보다 전문적인 기능을 세포의 다른 종류가 될 수있는 잠재력을 가지고, 과학의이 약속은 질병을 치료하는 세포 기반 치료법​​의 가능성을 조사하기 위해 과학자을 선도하고 있습니다. 언제 antidif​​ferentiation 요소없이 서스펜션의 문화, 배아 줄기 세포는 저절로 차별과 입체 다세포 합산를 형성하고 있습니다. 이러한 세포 집계는 embryoid 단체 (EB)라고합니다. 드롭 문화를 교수형에 처하는 것은 널리 사용 EB 형성 유도 방식입니다. 매달려 드롭의 둥근 바닥 MES 세포에게 성형 EBS를위한 좋은 환경을 제공할 수있는 ES 세포의 집합 수 있습니다. 교수형 드롭 aggregatied ES 세포의 숫자는 페트리 접시의 뚜껑에서 드롭으로 멈춘 것으로 초기 세포 현탁액에있는 세포의 수를 변화에 의해 제어할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 reproducibly ES 세포의 미리 정해진 숫자의 균질 EBS를 형성할 수 있습니다.

이 동영상은 매달려 드롭 방법을 사용하여 embryoid 기관에 마우스 배아 줄기 세포의 체외 차별에 수행하는 방법을 보여줍니다.

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

줄기세포는 매우 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 놀라운 잠재력을 가지고 있습니다. 줄기세포가 분열할 때, 각각의 새로운 세포는 ...할 수 있는 잠재력을 갖습니다.

줄기세포는 신체의 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 놀라운 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 일종의 신체 수복 시스템 역할을 합니다. 이론적으로 줄기세포는 무제한으로 분열하여 다른 세포들을 보충할 수 있습니다.줄기세포가 분열할 때, 생성된 각각의 새로운 세포는 줄기세포로 남거나 더 전문화된 기능을 가진 다른 유형의 세포로 분화할 가능성을 가지고 있습니다. 이러한 유망한 과학 분야를 통해 과학자들은 질병을 치료하기 위한 in vitro 세포 기반 치료법의 가능성을 연구하고 있습니다. 배아줄기세포의 분화는 세포들이 부유 배양 상태에서 응집될 때 일어납니다.마우스 배아 섬유아세포 공급 세포와 백혈병 억제 인자가 없는 상태에서 이러한 세포 응집체는 배아체라고 불립니다. 현수적법(hanging drop method)은 줄기세포를 인비트로(in vitro)에서 배아체로 분화시키는 효과적인 절차 중 하나입니다. 안녕하세요, 스탠퍼드 대학교 심혈관 의학과의 Sha Juan입니다.오늘은 핸드 드롭(hand drop)법을 이용해 배아줄기세포를 개별적으로 분화시켜 배아체(embryoid body)를 형성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 일반적으로 이 방법을 사용하여 배아줄기세포를 심근세포로 분화시킵니다. 본 절차에는 배아줄기세포의 단일 세포 현탁액 준비, 핸드 드롭 배양 생성, 핸드 드롭 배양물을 초저부착(ultra low attachment) 플레이트로 옮기기, 그리고 배아체를 젤라틴 코팅된 플레이트에 도말하는 단계가 포함됩니다.이제 시작하겠습니다. 실험 과정의 첫 번째 단계는 배아줄기세포의 단일 세포 현탁액을 준비하는 것입니다. 미분화 배아줄기세포를 마우스 배아 섬유아세포 위에서 배양하므로, 세포를 분리하여 섬유아세포로부터 떼어내야 합니다.이를 위해 표준 절차에 따라 세포를 트립신 처리합니다. 트립신 처리가 완료되면, 트립신을 중화시키기 위해 마우스 배아줄기세포 배지를 첨가합니다. 그다음, 세포 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.그 다음, 튜브 바닥에 대고 피펫팅을 반복하여 세포 군집을 분해함으로써 눈에 보이는 덩어리가 없는 미세한 세포 현탁액을 얻습니다. 이제 세포를 1,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 10 mL의 mouse ES cell Medium으로 세포를 재현탁합니다.세포 현탁액을 0.1% gelatin으로 미리 코팅한 T 75 플라스크로 옮기고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후면 섬유아세포는 플레이트에 부착되지만, 줄기세포는 배지에 남아 있게 됩니다. 배지를 피펫으로 흡입하여 줄기세포를 수집합니다.세포를 1,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 분화 배지 10 mL를 추가하고, 세포가 미세하게 현탁될 때까지 반복적으로 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.이제 현적법(hanging drop method)을 사용하여 세포 현탁액을 배양할 준비가 되었습니다. 현적 배양을 시작하려면, 분화 배지를 사용하여 줄기세포 현탁액을 20 µL당 500 cells의 농도로 희석하십시오. 그다음, 150 mm 조직 배양 플레이트 덮개를 뒤집으십시오.그 다음, 세포 현탁액 20 µL를 플레이트 커버의 안쪽 표면에 피펫팅합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트에 PBS 10 mL를 추가합니다. 플레이트 커버를 빠르게 뒤집어 플레이트 위에 조심스럽게 올려놓아 현탁 방울(hanging drops)을 형성합니다.플레이트 커버를 덮은 후, 플레이트를 조심스럽게 인큐베이터로 옮겨 배양합니다. 이틀 동안 세포를 그대로 둡니다. 배양이 완료되면, 행잉 드롭 배양물을 초저부착 플레이트로 옮기는 과정을 진행합니다.이틀 후, 플레이트 커버를 조심스럽게 뒤집어 다음으로 신선한 분화 배지 180 µL를 흡입하고, 이를 96-well 초저부착 플레이트에 몇 방울씩 떨어뜨립니다. 그다지 피펫으로 해당 방울들을 취해 96-well 플레이트로 하나씩 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 3일 동안 그대로 둡니다.배아 본체는 계속 성장하여 구형이 됩니다. 배양이 완료되면 배아 본체를 플레이팅할 준비가 됩니다. 이는 배아 본체가 계속해서 분화할 수 있도록 돕기 위함입니다.이를 48웰 젤라틴 코팅 플레이트로 옮깁니다. 이를 위해, 먼저 플레이트의 각 웰에 0.1% gelatin 300 µL를 코팅합니다. gelatin을 첨가한 후, 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 48웰 플레이트에서 젤라틴을 흡입하여 제거합니다. 그다음 각 웰에 분화 배지 300 µL를 첨가합니다. 이제 96웰 플레이트에 있는 배아체(embryo bodies)를 젤라틴이 코팅된 48웰 플레이트로 하나씩 옮깁니다.일반적으로 세포 유지를 위해 다음 날 배지를 교체하고 이후에는 격일로 교체합니다. 저희는 배아줄기세포 분화를 위한 더 나은 프로토콜을 찾기 위해 이 방법을 사용합니다. 심근세포의 경우, 현탁 배양법(hanging drop cultures)을 이용한 마우스 배아줄기세포의 체외 분화 수행 방법을 방금 보여드렸습니다.이 방법이 효과적인 이유는 현수적(hanging drop)의 둥근 바닥이 배아줄기세포의 응집을 가능하게 하여, 배아체(Embry bodies) 형성에 적합한 환경을 제공하기 때문입니다. 이 절차를 수행할 때, 초기 세포 현탁액 내의 세포 수를 조절함으로써 현수적에 응집되는 배아줄기세포의 수를 제어할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이상입니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다.

방울을 공중 Shrinky - 딩크 : Embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

이 비디오는 행잉 드롭 방법에 의한 마우스 배아 줄기 세포(mESC)와 배아체(EB)의 분화를 보여줍니다. mESC를 매달린 방울에 현탁시키고 배양하면 세포가 응집하여 EB를 형성하고, EB는 레티노산(RA)이 보충된 분화 배지를 사용하여 신경 전구 세포(NPC)로 더욱 분화됩니다.

Hanging Drop 방법에 의한 마우스 배아 줄기 세포로부터 신경 전구 생성

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

학습하세요 마우스 배아 줄기세포의 체외 분화를 공중 드롭 방법으로 유도하는 기술을. 이 방법은 배아체 형성과 재생의학 연구에 활용됩니다.

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

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