2008년 7월 23일
이 동영상은 매달려 드롭 방법을 사용하여 embryoid 기관에 마우스 배아 줄기 세포의 체외 차별에 수행하는 방법을 보여줍니다.
줄기세포는 체내에서 다양한 유형의 세포로 발전할 수 있는 놀라운 잠재력을 가지고 있습니다. 신체를 위한 일종의 복구 시스템 역할을 합니다. 이론적으로 제한 없이 분열하여 다른 세포를 보충할 수 있습니다.
줄기세포가 분열할 때, 각각의 새로운 세포는 줄기세포로 남을 수도 있고, 더 전문화된 기능을 가진 다른 유형의 세포가 될 수도 있습니다. 이 유망한 과학 분야는 과학자들이 체외 질환을 치료하기 위한 세포 기반 치료법의 가능성을 조사하도록 이끌고 있습니다. 배아 줄기 세포의 분화는 세포가 현탁 배양에서 응집될 수 있을 때 발생합니다.
마우스 배아(mouse embryonic), 섬유아세포 공급기(fibroblast feeder) 및 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)가 없는 경우, 이러한 세포 응집체를 배아체(embryo bodies)라고 합니다. 행잉 드롭(hanging drop) 방법은 시험관 내에서 줄기세포를 배아체로 분화시키는 효과적인 절차 중 하나입니다. 안녕하세요, 저는 스탠포드 대학의 심혈관 의학과 왼손잡이 출신의 Sha Juan입니다.
오늘은 핸드 드롭 방법을 사용하여 배아 줄기 세포를 개별적으로 분화하여 몸을 뿜어내는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 일반적으로 이 방법을 사용하여 배아 줄기 세포를 심근세포로 분화합니다. 이 절차는 다음 단계를 포함하여 배아 줄기 세포의 단일 세포 현탁액을 준비하고, 핸드 드롭 배양을 생성하고, 핸드 드롭 배양을 초저 부착 플레이트로 옮기고, 주트 코팅 플레이트에 도금 자수체를
이식합니다.자, 시작하겠습니다. 절차의 첫 번째 단계는 배아 줄기 세포의 단일 세포 현탁액을 준비하는 것입니다. 우리는 미분화 배아 줄기세포를 마우스 배아 섬유아세포에서 성장시켜 배양하기 때문에 세포를 분리하고 섬유아세포에서 분리해야 합니다.
이를 위해 우리는 표준 절차를 사용하여 세포를 트립 항닉합니다. 시도 및 치료가 완료되면 마우스 배아 줄기 세포 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 15mil 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 눈에 보이는 덩어리 없이 세포의 미세한 현탁액을 얻을 때까지 튜브 바닥에 대해 위아래로 피펫팅하여 세포 군집을 분해합니다. 이제 5분 동안 1,000RPM으로 셀을 돌립니다. 회전 후 세포는 상층(supernat)을 흡인하고 10mil의 마우스 ES 세포로 세포를 재현탁합니다. 보통.
세포 현탁액을 0.1%젤라틴이 사전 코딩된 T 75 플라스크로 옮기고 37도에서 5%CO2로 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 섬유아세포는 플레이트에 부착되지만 줄기세포는 배지에 남아 있습니다. 줄기세포를 채취하기 위해 배지를 피펫으로 올립니다.
5분 동안 1,000RPM으로 셀을 회전시키고 배지를 흡인합니다. 그런 다음 또 다른 10mil의 분화 배지를 추가하고 세포의 미세한 현탁액이 나타날 때까지 반복적인 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다. 혈류 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다.
이제 행잉 드롭(hanging drop) 방법을 사용하여 세포 현탁액을 배양할 준비가 되었습니다. 행잉 드롭 배양을 시작하려면 분화 중앙값을 사용하여 줄기 세포 현탁액을 20마이크로리터당 500개 세포의 농도로 희석합니다. 다음으로 150mm 조직 배양 플레이트 덮개를 뒤집습니다.
그런 다음 20 마이크로 리터의 셀 현탁액을 플레이트 커버의 내부 표면에 피펫으로 넣습니다. 멀티채널 피펫터를 사용하여 플레이트에 10mil의 PBS를 추가합니다. 플레이트 커버를 빠르게 뒤집고 플레이트에 부드럽게 올려 매달린 방울을 형성합니다.
플레이트 덮개가 제자리에 고정되면 플레이트를 인큐베이터 배양기로 조심스럽게 옮깁니다. 세포는 이틀 동안 방해받지 않았습니다. 배양이 완료되면 행잉 드롭 배양물을 초저 부착 플레이트로 옮기는 작업을 진행할 것입니다.
이틀 후, 플레이트 커버를 조심스럽게 뒤집어 180 마이크로 리터의 새로운 분화 매체를 흡입하고 96 웰 초저 부착 플레이트에 여러 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 피펫으로 방울을 집어 96웰 플레이트에 하나씩 옮깁니다. 플레이트를 3일 동안 방해받지 않고 인큐베이터에 넣습니다.
배아체는 공 모양으로 계속 자랄 것입니다. 배양이 완료되면 배아를 플레이트로 만들 준비가 됩니다. 배아체가 계속 분화할 수 있도록 돕기 위해서입니다.
우리는 그것들을 48웰 젤라틴 코팅판으로 옮깁니다. 이를 위해 먼저 플레이트의 각 웰을 300마이크로리터의 0.1% 젤라틴으로 코팅합니다. 젤라틴을 넣은 후 섭씨 37도에서 밤새 접시를 배양합니다.
다음 날, 48웰 플레이트에서 젤라틴을 흡입합니다. 그런 다음 각각에 300마이크로리터의 분화 배지를 추가합니다. 자, 이제 배아를 96웰에서 48웰 젤라틴 코팅판으로 하나씩 옮깁니다.
우리는 보통 세포를 유지하기 위해 다음날 배지를 교체하고 격일로 배지를 교체합니다. 우리는 배아 줄기 세포를 분화하기 위한 더 나은 프로토콜을 찾기 위해 이 방법을 사용합니다. 심근세포에서는 행잉 드롭 배양을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화를 수행하는 방법을 보여드렸습니다.
이 방법은 매달린 방울의 둥근 바닥이 배아 줄기 세포의 응집을 허용하여 배아 줄기 세포의 형성을 위한 좋은 환경을 제공하기 때문에 효과적입니다. 이 절차를 수행할 때, 행잉 드롭(hanging drop)에 응집된 배아 줄기 세포의 수는 초기 세포 현탁액의 세포 수를 변화시켜 제어할 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그거에요.
시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.
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이 비디오는 떨어지는 방울 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포를 배아체로 분화시키는 것을 시연합니다. 줄기 세포는 다양한 세포 유형으로 발달할 가능성이 있어 신체의 복구 시스템으로 작용합니다.
Controlled embryoid body formation enables reproducible in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine research. The hanging drop method provides a scalable, standardized approach to generate homogeneous multicellular aggregates, reducing variability in downstream phenotypic screening and assay development. This technique enhances predictive confidence by allowing precise cell number control, facilitating consistent embryoid body generation for therapeutic hypothesis testing.
The hanging drop method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation through lead identification and preclinical validation, enabling standardized embryoid body generation for therapeutic screening.