공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

줄기세포는 신체의 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 놀라운 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 일종의 신체 수복 시스템 역할을 합니다. 이론적으로 줄기세포는 무제한으로 분열하여 다른 세포들을 보충할 수 있습니다.

줄기세포가 분열할 때, 생성된 각각의 새로운 세포는 줄기세포로 남거나 더 전문화된 기능을 가진 다른 유형의 세포로 분화할 가능성을 가지고 있습니다. 이러한 유망한 과학 분야를 통해 과학자들은 질병을 치료하기 위한 in vitro 세포 기반 치료법의 가능성을 연구하고 있습니다. 배아줄기세포의 분화는 세포들이 부유 배양 상태에서 응집될 때 일어납니다.

마우스 배아 섬유아세포 공급 세포와 백혈병 억제 인자가 없는 상태에서 이러한 세포 응집체는 배아체라고 불립니다. 현수적법(hanging drop method)은 줄기세포를 인비트로(in vitro)에서 배아체로 분화시키는 효과적인 절차 중 하나입니다. 안녕하세요, 스탠퍼드 대학교 심혈관 의학과의 Sha Juan입니다.

오늘은 핸드 드롭(hand drop)법을 이용해 배아줄기세포를 개별적으로 분화시켜 배아체(embryoid body)를 형성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 일반적으로 이 방법을 사용하여 배아줄기세포를 심근세포로 분화시킵니다. 본 절차에는 배아줄기세포의 단일 세포 현탁액 준비, 핸드 드롭 배양 생성, 핸드 드롭 배양물을 초저부착(ultra low attachment) 플레이트로 옮기기, 그리고 배아체를 젤라틴 코팅된 플레이트에 도말하는 단계가 포함됩니다.

이제 시작하겠습니다. 실험 과정의 첫 번째 단계는 배아줄기세포의 단일 세포 현탁액을 준비하는 것입니다. 미분화 배아줄기세포를 마우스 배아 섬유아세포 위에서 배양하므로, 세포를 분리하여 섬유아세포로부터 떼어내야 합니다.

이를 위해 표준 절차에 따라 세포를 트립신 처리합니다. 트립신 처리가 완료되면, 트립신을 중화시키기 위해 마우스 배아줄기세포 배지를 첨가합니다. 그다음, 세포 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

그 다음, 튜브 바닥에 대고 피펫팅을 반복하여 세포 군집을 분해함으로써 눈에 보이는 덩어리가 없는 미세한 세포 현탁액을 얻습니다. 이제 세포를 1,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 10 mL의 mouse ES cell Medium으로 세포를 재현탁합니다.

세포 현탁액을 0.1% gelatin으로 미리 코팅한 T 75 플라스크로 옮기고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후면 섬유아세포는 플레이트에 부착되지만, 줄기세포는 배지에 남아 있게 됩니다. 배지를 피펫으로 흡입하여 줄기세포를 수집합니다.

세포를 1,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 분화 배지 10 mL를 추가하고, 세포가 미세하게 현탁될 때까지 반복적으로 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

이제 현적법(hanging drop method)을 사용하여 세포 현탁액을 배양할 준비가 되었습니다. 현적 배양을 시작하려면, 분화 배지를 사용하여 줄기세포 현탁액을 20 µL당 500 cells의 농도로 희석하십시오. 그다음, 150 mm 조직 배양 플레이트 덮개를 뒤집으십시오.

그 다음, 세포 현탁액 20 µL를 플레이트 커버의 안쪽 표면에 피펫팅합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트에 PBS 10 mL를 추가합니다. 플레이트 커버를 빠르게 뒤집어 플레이트 위에 조심스럽게 올려놓아 현탁 방울(hanging drops)을 형성합니다.

플레이트 커버를 덮은 후, 플레이트를 조심스럽게 인큐베이터로 옮겨 배양합니다. 이틀 동안 세포를 그대로 둡니다. 배양이 완료되면, 행잉 드롭 배양물을 초저부착 플레이트로 옮기는 과정을 진행합니다.

이틀 후, 플레이트 커버를 조심스럽게 뒤집어 다음으로 신선한 분화 배지 180 µL를 흡입하고, 이를 96-well 초저부착 플레이트에 몇 방울씩 떨어뜨립니다. 그다지 피펫으로 해당 방울들을 취해 96-well 플레이트로 하나씩 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 3일 동안 그대로 둡니다.

배아 본체는 계속 성장하여 구형이 됩니다. 배양이 완료되면 배아 본체를 플레이팅할 준비가 됩니다. 이는 배아 본체가 계속해서 분화할 수 있도록 돕기 위함입니다.

이를 48웰 젤라틴 코팅 플레이트로 옮깁니다. 이를 위해, 먼저 플레이트의 각 웰에 0.1% gelatin 300 µL를 코팅합니다. gelatin을 첨가한 후, 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 48웰 플레이트에서 젤라틴을 흡입하여 제거합니다. 그다음 각 웰에 분화 배지 300 µL를 첨가합니다. 이제 96웰 플레이트에 있는 배아체(embryo bodies)를 젤라틴이 코팅된 48웰 플레이트로 하나씩 옮깁니다.

일반적으로 세포 유지를 위해 다음 날 배지를 교체하고 이후에는 격일로 교체합니다. 저희는 배아줄기세포 분화를 위한 더 나은 프로토콜을 찾기 위해 이 방법을 사용합니다. 심근세포의 경우, 현탁 배양법(hanging drop cultures)을 이용한 마우스 배아줄기세포의 체외 분화 수행 방법을 방금 보여드렸습니다.

이 방법이 효과적인 이유는 현수적(hanging drop)의 둥근 바닥이 배아줄기세포의 응집을 가능하게 하여, 배아체(Embry bodies) 형성에 적합한 환경을 제공하기 때문입니다. 이 절차를 수행할 때, 초기 세포 현탁액 내의 세포 수를 조절함으로써 현수적에 응집되는 배아줄기세포의 수를 제어할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이상입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.