Name: 자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포를 MnCl₂로 라벨링하여 MRI에서 살아있는 세포를 추적하는 방법을. 전압 개폐 칼슘 채널을 통해 망간이 유입되어 생존 세포만 선별적으로 영상화할 수 있습니다.

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인간 배아 줄기 세포의 망간 라벨링 <ol><li> 피더없이 5 분 조건에서 양식되고있는 인간의 배아 줄기를 Trypsinize. 문화 미디어를 추가하여 트립신을 중화. </li><li> 20 5 분 800 rpm으로 centrifuging하여 세포를 스핀 다운 ° 섭씨. 다시 보류 세포 펠릿 후, trypan 파랑 얼룩에 의해 세포의 개수를 계산합니다. 얻은 세포 개수에 따라 원뿔 튜브에 3,000,000 세포 네 가지 aliquots으로 세포를 나눕니다. 원심 분리하여 다시 펠렛 세포. </li><li> 그냥 망간 상표를 시작하기 전에, 0.1mM 망간 염화 솔루션을 만들기 위해 0.9 %의 나트륨 염화물 솔루션 신선한 망간 염화을 풀다. </li><li> 칼슘 채널의 활동을 관찰하기 위해서는, 넷 샘플이 준비되었습니다. 첫 번째 예제는 혼자서 0.9 %의 나트륨 염화물에 incubated 세포를 포함 우리의 컨트롤입니다. 두 번째 예제 0.1 MM MnCl 2 incubated 세포가 포함되어 있습니다. 샘플 3 4 칼슘 2 + 채널 작용제 5 μm의 하나와 0.1 MM MnCl 2 incubated 세포 (S )-(-)- 베이 K8644, 또는 칼슘 2 + 채널 길항제, verapamil 250 μm의이 포함되어 있습니다. 37 네 개의 샘플을 품어 ° 30 분 5 % CO 2와 함께 섭씨. </li><li> 30 분 후에, 20 ° 섭씨에서 5 분 동안 800 rpm으로 세포를 스핀 다운. 그런 다음 뜨는을 대기음하고 PBS로 두 번 표시된 세포를 씻으십시오. 세척 후, PCR 튜브에 200 μL PBS 및 전송하여 각 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이 알약은 보통 흰색입니다. </li></ol> 인간 배아 줄기 세포의 이런 라벨링 <ol><li> 1 MG / ML 재고 솔루션을 위해 증류수와 임상 수준 프로타민 황산을 섞는다. </li><li> 인간 배아 줄기 세포 배양 매체를 포함하는 튜브에 12 μg / ML 프로타민 황산의 또한 다음에 100 μg / ML에서 ferumoxides를 추가합니다. 5 분 동안 적극적으로 솔루션을 섞는다. </li><li> 50 μg / ferumoxides의 ML 6 레이블 세포에 프로타민 황산의 μg / ML의 최종 농도를 달성하기위한 세포 배양 매체의 동일한 금액에 혼합 솔루션을 추가합니다. 12 시간이 솔루션에 세포를 품어. </li><li> 세포외 ferumoxides - 프로타민 황산 복합을 해산하기 위해 10U/ml 헤파린이 들어있는 마지막으로 세척과 함께 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세척 후, 세포가 하나의 세포 현탁액을 얻는 trypsinize. </li><li> 샘플 필요한 번호로 세포가 나누어지는 카운트. 세척 후, PCR 튜브에 200 μL PBS 및 전송하여 각 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이 알약은 색깔에서 짙은 주황색 갈색해야합니다. </li></ol> 세포 자기 공명 영상 공연 <ol><li> 셀 알약이 들어있는 튜브를 안정화하고 또한 스캔하는 동안 주위의 공기에서 유물을 피하기 위해 유령을 만듭니다. 이렇게하려면, 증류수에 한천의 0.8 %와 구리 황산의 1 %를 혼합하고 5~7분에 대한 microwaving하여 끓기 가져. 젤을 달성하기 위해 스캔 전에 최소한 1 시간 동안이 혼합물을 쿨. </li><li> 표시 셀 알약을 포함하는 튜브는 스캔에 대한 환상에 배치됩니다. 체외 세포 MRI 임상 무릎 코일을 사용하여 Signa HDx 3T MRI (GE 의료 시스템)에서 수행됩니다. </li><li> 스핀 에코 시퀀스를 사용 세 가지 샘플의 각 망간 전지 라벨 스캔 : TR을, 반복 시간 = 800 밀리초. TE, 에코 시간 = 최소, FOV,보​​기의 분야 = 12 X 12cm, 매트릭스 = 256x256, NEX 1. </li><li> 그라디언트 - 에코 시퀀스를 사용하여 철분 라벨 세포를 검사합니다. 이 영상에 대해 다음 매개 변수를 사용 : TR = 100 밀리초, TE = 10 밀리초, FA, 플립 각도 = 30 °, FOV = 12 X 12cm, 매트릭스 = 256 X 256, NEX 1. </li></ol> MRI 결과 분석 <ol><li> 망간 - 라벨 세포의 4 개의 샘플에서 MRI 스캔 이미지를 분석 : <ul><li> 샘플 # 1은 혼자 0.9 %의 나트륨 염화물에 incubated 세포를 포함 우리의 컨트롤입니다. </li><li> 샘플 # 2는 0.1 MM MnCl 2 incubated 세포가 포함되어 있습니다. </li><li> 샘플 # 3 칼슘 2 + 채널 작용제 5 μm의, (S )-(-)- 베이 K8644과 함께 0.1 MM MnCl 2 incubated 세포가 포함되어 있습니다. </li><li> 샘플 # 4 칼슘 2 + 채널 길항제, verapamil 250 μm의와 0.1 MM MnCl 2 incubated 세포가 포함되어 있습니다. </li></ul></li><li> 으로 예측, 망간 전지 라벨에서 신호 강도의 차이는 볼 수 있습니다. 망간과 순수라는 세포에 비해 신호 강도가 명확하게 칼슘 채널 작용제의 존재의 증가와 칼슘 채널 길항제의 존재에 줄어 듭니다. 신호 강도가 표시 망간 전지 증가 지역은 이미지 J을 (NIH, 베데스다, MD, 미국)를 사용하여 측정됩니다. 동일한 소프트웨어는 철 표시 세포의 어두운 오프 공명 신호의 영역을 분석하는 데 사용됩니다. 철 - 라벨 세포의 어두운 신호의 크기는 세포 또는 세포에 의해 포함된 철 입자의 숫자의 수에 따라 달라집니다. 이 경우에는, 백만 세포는 삼백만 세포의 신호에 비해 어두운 신호의 작은 영역을 보여줍니다. </li></ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

이러한 결과는 망간도 세포 생존을 보여줄 수 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 및 망간은 MRI 대비 에이전트로 사용할 수를 통해 입력 않는다는 것을 나타냅니다. 따라서, 우리는 망간 - 안내 MRI는 myocardium로 인간 배아 줄기 세포의 이식 후 세포 생존을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>염화 망간 사수화물</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(-)-Bay K8644 </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Verapamil hydrochloride, 최소 99.0% titration </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>염화 나트륨 0.85-0.90% W/V</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V. </td><td>시약</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>ferumoxides 주사 용액 11.2mg iron/mL</td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>시약</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR (ES 세포용 혈청 대체제)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2- mercapt&amp;#8211;thanol 98+%</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM 100x</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 100x 용액</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Signa HDx 3T MRI</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>임상용 무릎 코일</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

인간 배아 줄기 세포는 (hESC) 부상 myocardium를 복원하는 능력을 증명하고있다. 자기 공명 영상 (MRI)는 부상 myocardium의 복원을 평가하는 주된 이미징 modalities 중 하나로 떠오르고있다. 또한, 이러한 철 - 산화 nanoparticles으로 전 생체내 라벨 에이전트는, 추적하기 위해 고용 및 이식 줄기 세포를 집중하고 있습니다. 그러나,이 방법은 이식 세포의 생존에 관한 근본적인 세포 생물학 속성을 모니터하지 않습니다. 그것은 망간 염화 (MnCl 2) 전압 - 문이 칼슘 (칼슘 2 +) 세포 생물학적으로 활성화되어 채널을 통해 세포를 입력하고, T 1 단축 효과를 생성하는 intracellularly 축적되는 것으로 알려져있다. 따라서, 우리는 망간 - 안내 MRI는 myocardium에 hESC의 이식 후 세포 생존을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 이 비디오에서는, 우리는 MnCl 2 어떻게 이들 세포는 명확하게 체외에서 MRI를 사용하여 볼 수와 hESC 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 동시에, CA 2 생물 학적 활동 + - 채널 수반하는 신호 변경을 평가하기 위해 칼슘 2 + 채널 작용제 및 길항제를 모두 활용 변조된 것이다.

이 비디오에서는, 우리는 망간 염화와 인간의 배아 줄기 세포를 (hESC) (MnCl 라벨하는 방법을 보여주는데<sub&gt; 2</sub&gt;) 세포 생물학적으로 활성화된 경우 전압 - 문이 칼슘 채널을 통해 세포를 입력할 수있는. 또한, 우리는 MnCl의 사용을 보여<sub&gt; 2</sub&gt; 셀룰러 MRI 대비 에이전트로 hESC의에서 체외의 생존을 결정합니다.

인간 배아줄기세포(hESC)는 손상된 심근을 복구하는 능력이 있음이 입증되었습니다. 자기공명영상(MRI)은 ... 중 하나로 부상하였습니다.

자기공명영상(MRI)은 이식된 줄기세포의 위치를 파악하고 재생 기전을 더 잘 이해하기 위한 주요 영상 기법으로 부상했습니다. 이러한 MRI 연구에서는 일반적으로 산화철 나노입자를 영상 조영제로 사용합니다. 그러나 철 입자는 줄기세포 사멸 후에도 조직에 남아있을 수 있으며, 대식세포에 의해 섭취될 수 있어 생존해 있는 이식 세포를 추적하는 데 최적이지 않은 조건을 형성할 수 있습니다.이 영상에서는 염화 망간이 효과적인 대안임을 보여줄 것입니다. 염화 망간을 이용한 조영제 표지는 산화 철 표지에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 이온 입자는 음성 신호를 생성하는 반면 망간은 양성 신호를 생성합니다.또한, 망가니즈 이온은 전압 개폐형 칼슘 채널을 통해 세포 내로 유입되는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 MRI에서 망가니즈가 관찰된다는 것은 생물학적으로 활성 상태인 생존 세포가 있음을 나타냅니다. 안녕하세요, 저는 스탠퍼드 대학교 심혈관 의학과의 Philip Yang 교수 연구실에 소속된 Uni mother입니다.오늘은 자기공명영상을 위해 망간으로 인간 배아줄기세포를 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 절차에는 조영제로 인간 배아줄기세포를 표지하고, 인비트로(in vitro) 세포 자기공명영상을 수행하며, MRI 결과를 분석하는 단계가 포함됩니다. 그럼 시작하겠습니다.라벨링 절차의 첫 번째 단계는 태아 혈청이 없는 조건에서 배양된 인간 배아줄기세포를 준비하는 것입니다. 이를 위해 세포를 trypsin으로 5분 동안 처리한 후, 배양액을 첨가하여 trypsin을 중화시킵니다. 다음으로, 20°C에서 800 RRP M으로 5분간 원심 분리하여 세포를 침전시킵니다.PBS로 세포 펠렛을 재현탁한 후, 트립판 블루 염색을 통해 세포 수를 측정하십시오. 얻어진 세포 수에 근거하여 세포를 원추형 튜브에 필요한 수량만큼 분할하십시오. 이 경우에는 세포를 300만 개씩 4개의 튜브로 나눕니다. 망간 표지를 시작하기 직전에 원심분리를 통해 세포 펠렛을 다시 형성하십시오. 신선한 염화망간을 0.9% 염화나트륨에 녹여 0.1 mM 염화망간 용액을 제조하십시오.칼슘 채널 활성을 관찰하기 위해 샘플을 준비하였습니다. 첫 번째 샘플은 0.9% sodium chloride만으로 배양한 세포가 포함된 대조군입니다. 두 번째 샘플에는 0.1 millimolar manganese chloride로 배양한 세포가 포함되어 있으며, 세 번째

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생물학

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

이 동영상은 형광 염료와 인간 배아 줄기 세포 및 mesenchymal 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광학 이미징과 이식 줄기 세포의 생체내 추적에와 형광 현미경과 histopathological 상관 관계에 대해 사용할 수 있습니다.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

줄기 세포 요법에 대한 관심이 점점으로, 분자 이미징 기술은 이식 후 모니터링 줄기 세포 행동에 이상적입니다. 루시페라제 리포터 유전자는 세포 생존, 위치 및 생체내의 확산의 비침습, 반복적인 평가를 활성화합니다. 이 동영상은 살아있는 마우스의 hESC 확산을 추적하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명...

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

우리는 생체 표지 세포와 마우스 모델에서 MRI를 사용하여 생체 내 세포 추적을위한 일반적인 프로토콜을 설명합니다. 셀 라벨, 이미지 수집 처리 및 정량화를위한​​ 일반적인 프로토콜이 포함되어 있습니다.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

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배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

여기에 제시된 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달 및 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 추적을 위한 프로토콜이 제시된다. 초파라마그네틱 산화물 나노입자는 실시간 MRI를 이용한 비강 내 전달 후 생체 내 추적 및 비침습적 MSC 라벨링을 위한 자기 공명 영상(MRI) 프로브로 사용된다.

외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

배우세요 인간 배아 줄기 세포를 MnCl₂로 라벨링하여 MRI에서 살아있는 세포를 추적하는 방법을. 전압 개폐 칼슘 채널을 통해 망간이 유입되어 생존 세포만 선별적으로 영상화할 수 있습니다.

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