단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

광학 현미경은 생의학 연구 분야에서 가장 유용하거나, 혹은 그에 못지않게 필수적인 도구 중 하나입니다. 응용 분야에 따라 시료 관찰에 적합한 조명 방식이 달라집니다. 이 영상에서는 투과광 조명의 두 가지 광학 방식인 위상차 현미경과 DIC(미분 간섭 대비) 현미경에 대해 시연하겠습니다.

안녕하세요, 저는 텍사스 대학교 헬스 사이언스 센터 샌안토니오 캠퍼스의 광학 이미징 코어 시설의 Victoria San Frolic입니다. 오늘은 위상차 현미경과 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 시료를 올바르게 관찰하는 방법을 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

표준 명시야 현미경은 투명하고 색이 없는 시료를 관찰하기에 적합하지 않습니다. 위상차 현미경은 빛을 흡수하지 않는 투명한 생물학적 시료의 대비를 생성하기 위해 자주 사용됩니다. 이 기술은 1942년 Zernike에 의해 발견되었으며, 그는 이 업적으로 노벨상을 수상하였습니다.

위상차 현미경은 위상판 또는 링이 포함된 특수 위상차 대물렌즈와 다이어프램 대신 콘덴서 환형 조리개(annulus)가 추가된 명시야 광학 현미경입니다. 환형 조리개는 보통 콘덴서 터렛에 위치하며, 사용하는 대물렌즈에 맞춰 환형 조리개의 크기를 선택해야 합니다. 쾰러 조명(Kohler illumination)을 설정한 후, 적절한 위상차 대물렌즈를 선택하고 콘덴서 내에서 그에 맞는 위상차 환형 조리개를 회전시켜 위치시킵니다.

대물렌즈 위상 환과 콘덴서 환이 적절히 정렬되어 동심원을 이루며 겹쳐지면, 시편을 관찰하고 초점을 적절히 조절할 수 있습니다. 이제 현미경을 통해 본 위상차 모습이 어떠한지 보여드리겠습니다. 여기 쥐 간 조직 절편의 모습이 있습니다.

위상차 현미경 하에서의 모습입니다. 이 방법은 대조도를 다양한 회색조에서 흑백조로 변화시켜 생물학적 시료의 가시성을 높여줍니다. 하지만 시료 주변에 후광(halo) 현상이 나타나 미세 구조가 가려지는 것을 확인할 수 있습니다.

이 헤일로는 위상환(phase annulus) 조명으로 인해 발생하는 아티팩트입니다. 이제 명시야(brightfield)로 전환하면, 이 시료를 관찰하기가 매우 어렵다는 것을 알 수 있습니다. 다시 위상차(phase contrast)로 전환하면, 1960년대 후반 도입된 이래로 쥐 간 조직 내 세포의 구조와 형태를 명확하게 확인할 수 있습니다.

미분 간섭 대비 또는 DIC 현미경은 대비가 강한 인터페이스를 강화하여 미세 구조의 고해상도 이미지를 생성하기 때문에 생의학 연구에서 널리 사용되어 왔으며, 생성된 이미지는 매우 얇은 광학 단면의 형태를 띱니다. 실제로 DIC의 광학 단면 생성 능력은 공초점 현미경의 보완적인 투과광 조명 방식으로 유용하게 활용되어 왔습니다. DIC 현미경은 명시야 광학 현미경에 광원과 콘덴서 사이에 편광자가 추가된 형태의 장치입니다.

콘덴서 부분의 DIC 빔 분할 프리즘, 대물렌즈 바로 뒤의 DIC 빔 결합 프리즘, 그리고 두 렌즈 사이의 무한 공간에 위치한 분석기가 있습니다. DIC 광학계에서 최상의 성능을 얻으려면, 먼저 광학 현미경을 쾰러 조명(Kohler illumination)에 맞게 정렬한 후 광로에 DIC 구성 요소를 배치하는 것이 중요합니다. 광원으로부터 나온 빛은 편광판을 통과한 후 첫 번째 프리즘에 의해 분할됩니다.

이 쌍을 이룬 빔들은 서로 근접하여 이동합니다. 만약 이 쌍이 모두 시편 내의 동일한 물질을 통과했다면, 두 번째 프리즘에 의해 재결합될 때 서로 간섭하지 않으므로 회색으로 보입니다. 하지만 구조의 가장자리에서는 쌍을 이룬 빔 중 하나가 상대 빔과는 다른 물질을 통과하게 되어 변화가 일어납니다.

이 광선들이 두 번째 프리즘에 의해 다시 결합되면, 보강 간섭을 일으켜 밝은 점을 생성하거나 상쇄 간섭을 일으켜 어두운 점을 생성하게 됩니다. 여기 DIC 대비로 관찰한 규조류의 모습이 있습니다. 규조류 구조의 미세한 세부 사항이 쉽게 확인되는 것을 알 수 있습니다.

하지만 DIC 광학계를 제거하면 이러한 세부 사항들은 사라집니다. 시료 전체의 대비는 한쪽은 밝고 다른 쪽은 더 어둡게 나타납니다. 이는 지형적인 입체감을 주는 것처럼 보이지만, 사실 이는 착시 현상입니다.

편광판을 교차 지점을 지나 반대편 대비 방향으로 회전시키면 그림자 효과의 방향을 반전시킬 수 있습니다. 지금까지 위상차 및 DIC의 광학 모드에 대해 살펴보았습니다. 다시 한번 상기시켜 드리자면, 위상차 제거(phase contrast elimination)는 대비가 있는 시료를 검은색에서 흰색으로 강화하여, 색이 없고 투명한 시료를 관찰하는 데 유용합니다.

DIC는 시료에 대비(contrast)를 생성하기도 합니다. 이는 얇은 광학 단면의 고해상도 이미지를 생성함으로써 이루어집니다. 이것이 전부입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 현미경 연구에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.