MODS의 결핵의 진단 방법과 내성 결핵을 multidrug

전 세계 인구 3명 중 1명이 결핵에 감염되어 있습니다. 활동성 결핵을 진단하면 활동성 결핵 환자가 치료를 받거나 사망할 때까지 매년 10명에서 15명의 다른 사람을 감염시키기 때문에 새로운 감염을 예방할 수 있습니다. Mods는 현미경 관찰, 약물 감수성 분석을 언급하지 않기 위해 사용하는 약어이며, 방법론이 설명됨에 따라 그 이름이 분명해질 것입니다.

짧은 비디오에서는 결핵 및 다제내성 결핵을 빠르고 저렴하게 진단하기 위한 mods 방법론을 간략하게 설명합니다. 이 동영상은 방법론을 단계별로 설명합니다. 액체 배양 작업이 생물 안전성에 미치는 영향에 대해 논의하고 이 방법론을 사용하는 데 필요한 몇 가지 중요한 품질 보증 문제에 대해서도 설명합니다.

mods assay는 페루 리마에 있는 Kayana University의 Bob Gilman의 실험실에서 개발되었습니다. 느슨한 cavi에 의해 처음에 관찰 된 내용을 따릅니다. LOOSE는 색량 지표를 사용하여 배양물에서 결핵균을 빠르게 검출하는 방법을 파악하려고 했습니다.

그러나 그녀는 현미경으로 이러한 배양을 관찰한 결과 Colormetric 지표의 색상이 변하기 며칠 전에 미생물이 성장한 것으로 나타났으며, 이러한 관찰을 기반으로 MOD의 분석이 개발되었다고 지적했습니다. MOD의 분석은 자원이 제한된 환경에서 개발되었으며 자원이 제한된 설정을 대상으로 하므로 액체 배양 기반 결핵 검출 및 다제내성 검출에 대해 테스트당 3개 미만입니다. 이는 매우 매력적이며, 자원이 제한된 곳에 처음으로 이러한 종류의 진단 능력을 제공합니다.

따라서 mods assay는 세 가지 핵심 원칙을 기반으로 합니다. 첫 번째는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이 고체 배지에서보다 액체 배지에서 훨씬 더 빠르게 성장한다는 것입니다. 이것은 수년 동안 알려진 사실입니다.

둘째, 현미경으로 이러한 액체 매체를 관찰하면 고체 매체에서 군체가 거시적으로 나타날 때까지 기다리는 것보다 훨씬 더 빠르게 myb 결핵의 성장을 감지할 수 있습니다. 그리고 실제로, 이러한 성장은 전적으로 특징적이어서 액체 매체 내의 M 결핵을 박테리아 또는 곰팡이 오염 또는 실제로 존재할 수 있는 비정형 비결핵 마이코박테리아의 성장과 구별할 수 있습니다. 마지막으로, 아마도 모드 분석에서 가장 흥미로운 점은 리팜피신이라는 약물을 통합할 수 있으므로 가래에서 직접 다중 약물 내성을 가질 수 있다는 것입니다.

분석 초기에 이러한 약물을 사용함으로써 결핵을 모두 검출할 수 있을 뿐만 아니라 분리체가 이 두 약물에 내성이 있는지 여부를 동시에 검출할 수 있습니다. 그리고 이것은 하위배양(subculture)의 필요성을 없애고 간접적인 약물 감수성 테스트를 만듭니다. 이제 mods assay를 수행하는 데 필요한 장비를 간략하게

준비된 미디어를 보관하려면 냉장고가 필요합니다. is와 Rifampin의 무게를 측정하려면 저울이 필요합니다. 가래를 혼합하려면 소용돌이가 필요합니다.

오염 제거 용액을 사용하면 오염이 제거된 가래 샘플을 농축하기 위해 원심분리기가 필요하며 이는 3000G를 달성할 수 있어야 합니다. 원심분리기는 냉장 보관할 필요가 없지만 바이오스 안전하고 바이오스 안전하다는 것이 절대적으로 중요합니다. 원심분리기의 버킷을 잠글 수 있는 뚜껑으로 밀봉할 수 있어야 하는 마이코박테리아 작업의 경우. 37도를 달성하고 섭씨 37도를 유지할 수 있는 인큐베이터가 필요합니다.

이것은 CO2가 풍부할 필요가 없습니다. mods plates를 판독하려면 도립 현미경이 필요하며, 여기에는 4x 및 10x의 대물렌즈가 있어야 하며 매체를 멸균하고 미생물 배양을 처리하기 위해 오토클레이브가 필요하며, 생물 안전 캐비닛인 배지의 분취를 위해 폐기물 마이크로가 필요합니다. 클래스 2는 가래 샘플의 조작 및 플레이트의 접종과 관련된 절차에 필요합니다.

mods asay를 수행하는 데 필요한 시약은 Middlebrook seven H nine media cascione과 항생제 보충제 및 OADC인 글리세롤 판타입니다. 항생제의 영양 보충제 재고는 리팜핀 디메틸 설폭사이드, 리팜피신, 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 가래 오염 제거를 위한 닐 시스테인 디, 인산나트륨 및 인산나트륨 인산염 완충액 준비를 위한 모노 포타슘 포스페이트, 감염된 폐기물 처리를 위한 10% 차아염소산나트륨 및 작업 표면 청소를 위한 소독제입니다. 다음과 같은 플라스틱 및 소모품도 필요합니다 : 멸균 유리관, 수성 용제 용 0.2 마이크로 미터 필터 및 유기 용제 용 0.2 마이크로 미터 필터, 마이크로 원심 분리기 튜브, 15mil 원심 분리 튜브, 멸균 50 밀리리터, 10 밀리리터 혈청 학적 peppes, 과거 peppes 멸균 마이크로 피펫 팁 24 웰 조직 배양 유형 플레이트 및 밀봉 가능한 Ziploc 유형 백은 가래 샘플이 배지에 접종 된 후 24 웰 플레이트를 배치합니다.

미리 준비할 수 있는 4가지 그룹의 재고 솔루션이 있습니다. 인산염 완충액 용액은 인산나트륨, 디바 및 인산칼륨 모노 염기성 용액의 조합으로 만들어지며 pH 6.8 ± 0.2로 조정됩니다. 이 용액은 섭씨 121도에서 124도에서 15분 동안 고압멸균하고, 영양 한천에 분취액을 배양하여 무균 상태를 확인합니다.

이것은 섭씨 2도에서 8도의 냉장고에 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 각 객담 샘플에는 10ml의 인산염 완충 용액이 필요합니다. 가래 오염 제거를 위한 원액은 수산화나트륨, 구연산나트륨 조합입니다.

이 해결책은 동일한 양에서 15 분 동안 섭씨 121에서 124 도에 압력가마로 결합되고 또한 1 달까지 동안 섭씨 2개에서 8 도의 냉장고에서 저장될지도 모릅니다. 이 용액은 각 객담 샘플에 2ml가 필요합니다. 염기성 배양 배지는 Middlebrook seven, H nine, cascione 및 glycerol로 구성됩니다.

7 H nine 분말은 글리세롤과 카시온을 함유 한 멸균 증류수에 용해되고 완전히 용해 될 때까지 일정한 교반으로 혼합됩니다. 이 매체는 섭씨 121도에서 124도에서 15분 동안 오토클레이브이며, 냉각 후 멸균 16 x 100mm 유리관에서 4.5밀리리터 쿼트로 나뉩니다. 배지는 무균 상태를 확인하기 위해 37도에서 48시간 동안 배양되며, 이 시간 이후에는 탁도가 낮아지며 최대 1개월 동안 뚜껑을 단단히 닫은 상태에서 섭씨 2도에서 8도에서 보관할 수 있습니다.

각 객담 샘플에는 이 배양액 4.5ml가 들어 있는 튜브 하나가 필요합니다. 중액 항생제 원액은 다음과 같이 제조되며, 멸균 증류수에 완전히 용해시키고 0.2 μm 주사기 필터로 여과하여 수용액을 넣는다. 그런 다음 20마이크로리터 분취액을 섭씨 영하 20도의 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 최대 6개월 동안 보관할 수 있으며, 각 20마이크로리터 분취액은 최대 100개의 샘플에 충분합니다.

밀당 8밀리그램의 리팜핀 원액은 리팜피신을 DMSO와 멸균 증류수에 용해시켜 제조합니다. 이 혼합물은 유기 용매에 대한 0.2 마이크로 미터 주사기 필터로 여과되며, 용액은 최대 6 개월 동안 섭씨 영하 20 도의 멸균 마이크로 원심 분리 튜브에 20 마이크로 리터 분취액에 저장할 수 있으며, 각 20 마이크로 리터 분취액은 최대 100 개의 샘플에 충분합니다. 이제 방법론 자체의 일부와 시술 당일에 취해야 할 세 가지 단계에 대해 알아보겠습니다.

이것은 재고 솔루션을 작업 솔루션으로 변환하는 것입니다. 먼저 오염 제거 솔루션이 있고 그 다음에는 미디어 솔루션이 있습니다. 그리고 마지막으로, 약물 isen과 Rifampin의 작업 솔루션

mods 방법론에 사용되는 오염 제거 방법은 표준화된 수산화나트륨 날크 오염 제거 방법론입니다. 날크는 점액 용해제로, 가래를 소화하고 수산화나트륨이 오염 제거를 할 수 있도록 도와줍니다. 이를 위해 수산화나트륨 구연산나트륨 원액이 필요하며 해당 용액 20ml에 NA 0.1g을 첨가합니다.

준비 당일에 사용하지 않은 용액은 폐기해야 합니다. 배양 배지의 최종 준비도 사용 당일에만 수행해야 합니다. 저장된 7개의 H 9 배지는 OADC 및 판타와 결합되며, 각 튜브에는 4.5밀리리터의 배지가 0.5밀리리터의 OADC 및 0.1밀리리터의 판타와 결합됩니다.

이는 하나의 샘플에 충분합니다. 각 약물의 작용 용액은 사용 당일에 준비되며, 사용하지 않은 용액은 활성을 보장할 수 없으므로 폐기해야 합니다. 저장된 분취량은 24로 희석됩니다. 웰 조직 배양 플레이트는 배지 7 H 9 oh A DC와 직렬로 표시하여 배지를 가진 객담 샘플이 첨가 된 후 달성되는 최종 웰 농도가 밀 포릭 산 당 0.4 마이크로 그램 및 리팜핀의 경우 밀 당 1 마이크로 그램이되도록합니다.

이제 오염 제거 절차로 넘어가서, 2mil의 가래 샘플을 원뿔형 Falcon 튜브에 넣고 2mil의 수산화나트륨 우유 오염 제거 용액을 추가합니다. 뚜껑을 교체하고 단단히 조인 후 현탁액이 소용돌이가 되고 15분 동안 그대로 두면 오염 제거 절차가 수행됩니다. 이 시간이 지나면 14 밀리리터의 인산염 완충 용액이 첨가됩니다.

뚜껑을 교체하고 단단히 조이고 튜브를 3000G에서 50분 후에 원심분리기에 넣고 S 상등액을 디캔팅하고 남은 펠릿은 7개의 H 9 OEDC 팬터의 5.1밀리리터 튜브를 사용하여 플레이트를 만들고자 하는 샘플입니다. 우리의 펠릿은 약 2 밀리리터의 부피로 재현탁됩니다. 이 재현탁 샘플의 절반은 마이크로 원심분리기 튜브에 백업으로 보관됩니다.

그런 다음 배양이 오염되어 샘플을 다시 플레이트아웃해야 하는 경우에 사용할 수 있습니다. 다른 밀리리터는 유리관에 있는 나머지 7개의 H nine oh DC 팬터에 추가되며, 이것은 도금할 준비가 된 샘플입니다. 이 매체 및 샘플의 현탁액 900 마이크로 리터는 24 웰 플레이트의 컬럼에있는 4 개의 웰 각각에 배치됩니다.

24웰 플레이트의 나머지 웰은 5개의 샘플이 5개의 컬럼 각각에 대해 하나씩 24웰 플레이트를 채우고 6번째 열에는 샘플이 없는 상태로 남도록 후속 샘플로 채워집니다. 여섯 번째 열은 이 열에 대한 음수 제어 역할을 합니다. 가래 샘플 없이 모든 배지 성분을 배치하고 이 열에 성장이 있으면 교차 오염에 문제가 있으며 전체 플레이트를 폐기해야 함을 분명히 나타냅니다.

우리가 실행하는 모든 플레이트에는 네거티브 컨트롤 컬럼이 필요합니다. 이제 모든 샘플과 매체가 포함된 플레이트가 있습니다. 우리는 별도의 플레이트에 항생제 현탁액을 추가해야 합니다.

앞서 설명한 대로 Rifampin과 Isid에 대해 설명한 대로 희석액을 준비했으며, 4채널 멀티 펫을 사용하여 각 웰에서 100마이크로리터를 수집하고 2개의 제어 웰 각각에 7개의 H 9 OADC 100마이크로리터를 분배하고 2개의 약물을 함유한 웰 각각에 100마이크로리터의 Rifampin과 100마이크로리터의 이시드를 분배합니다. 접시가 완성되면 뚜껑을 교체하고 내부에 넣습니다. 이 시점부터 백의 Ziploc 백은 다시 열리지 않으므로 액체 매체에서 자라는 배양물은 백을 떠날 기회가 없습니다.

지금부터 플레이트의 모든 판독은 백 내에서 이루어지며, 백은 오토클레이브 백에 넣고 배양이 끝나면 폐기됩니다. 그리고 이런 식으로, 우리는 마이코박테리아의 고농축 현탁액의 조작을 피합니다. 이제 품질 관리에 대해 몇 마디만 하겠습니다.

mods 방법론에는 분석의 적절한 사용에 필수적인 품질 관리 기능이 내장되어 있습니다. 우선, 네거티브 컨트롤이 있으며 이는 모든 단일 플레이트에서 실행됩니다. 이것들은 이전에 언급되었지만, 요약하자면, 플레이트에 5개의 다른 가래 샘플과 함께 가래 샘플이 없는 모든 배지 성분을 포함하는 컬럼이 있으며, 컬럼의 웰은 다른 웰과 마찬가지로 검사해야 하며, 이 웰에서 성장이 존재한다는 것은 교차 오염이 발생했음을 나타내며 따라서 플레이트의 결과 중 어느 것도 신뢰할 수 없음을 나타냅니다.

따라서 플레이트를 폐기하고 모든 샘플을 다시 플레이팅해야 합니다. 또한 긍정적 인 통제 인 내부 통제가 있습니다. 이들은 별도의 플레이트에서 실행되며, 이 플레이트는 실험실 내 교차 오염의 위험을 최소화하기 위해 하루가 끝날 때 다른 모든 샘플 플레이트를 준비한 후에 준비됩니다.

이 별도의 플레이트에서 완전히 감수성이 있는 결핵균 균주와 이시드 및 리팜피신에 내성이 있는 균주를 실행합니다. 플레이트에 다제내성 균주를 투여하는 것에 대한 우려가 있는 경우, 이 두 가지 감수성 및 MDR 균주 대신 모노 내성 균주 없이 리팜핀 모노 내성 균주를 실행할 수 있습니다. 이러한 균주의 목적은 미디어가 성장을 지원한다는 것을 입증하는 것뿐만 아니라, 따라서 우리의 모든 긍정적 인 대조군은 약물이없는 부에서 성장해야하지만, 우리의 약물 농도가 정확하므로 감수성이 높은 긍정적 인 대조군이 is와 Rifampin의 존재 하에서 성장해서는 안되며, 내성 양성 대조군은 분명히 Rifampin의 농도를 통해 성장해야하며 플레이트에 존재하는 것입니다.

자, 이제 플레이트 읽기로 넘어갑니다. 샘플러에서 도금하는 날을 고려하면 0일차 플레이트 판독은 5일째부터 시작됩니다. 그 전에는 마이코박테리아의 성장이 거의 관찰되지 않았습니다.

도립광 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 즉, 플레이트를 아래에서 위쪽으로 검사하며, 이를 통해 코드를 매우 명확하게 볼 수 있으며, 위에서 배양을 시각화하려는 시도는 플레이트 뚜껑의 응결로 인해 방해를 받고 초점 거리가 표준 현미경에 적합하지 않기 때문입니다. 현미경 검사는 일반적으로 10 x 객관적인 양성 배양으로 수행되며, 두 약물이 없는 우물 모두에 적어도 두 개의 집락 형성 단위가 있는 것으로 간주됩니다.

오염의 존재는 매체가 흐려지고 5일째가 되면 일반적으로 대부분의 우물이 과도하게 자라기 때문에 쉽게 인식됩니다. 대조적으로, 마이코박테리아의 성장은 마이코박테리아의 초기 성장이 작은 쉼표와 같은 형태를 형성하여 꾸준히 진행하여 특징적인 현 또는 엉킴을 형성하는 흐림을 초래하지 않습니다. 2주 이내에 매우 긍정적인 성장으로 인해 사지에서만 실제로 볼 수 있는 탯줄을 가진 마이코박테리아 덩어리가 형성될 것입니다.

양성이 될 배양물의 대다수는 14일째까지 양성 반응을 보이므로, 5일째부터 14일째까지 매일 판독을 권장하며, 그 이후에는 실험실 작업량에 따라 2일 또는 3일마다 판독을 권장합니다. 두 개의 무약물 웰에서 배양이 명확하게 양성인 날에는 약물이 함유된 웰을 판독해야 합니다. 두 약물 중 하나라도 성장하면 해당 약물에 대한 내성을 나타냅니다. 약물이 없는 우물에서 양성 배양이 관찰된 후 일주일 이상 경과한 후 우물을 포함하는 약물 영역이 수행된 경우, 이는 때때로 획기적인 성장이 보이기 때문에 내성을 나타내지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 매우 중요합니다.

배양이 음성인 경우 21일째에 판독이 중단될 수 있으며, 이 시간 이후에는 치료를 받지 않는 환자에서 양성 배양이 발생하지 않기 때문에 배양이 21일째 되는 날에 중단될 수 있습니다. 배양액은 지퍼락 백에 남아 있으며 오토클레이브 백에 넣고 섭씨 121-124도에서 45-60분 동안 오토클레이브를 거친 후 안전하게 폐기할 수 있습니다. 이제 생물 안전성과 모드 분석에 대해 몇 마디 말씀드리려고 하는데, 페루뿐만 아니라 아프리카와 아시아의 환경에서도 모드를 배포하고 있기 때문입니다.

액체 배지에서 미생물 배양을 사용하는 것의 보안과 생물학적 안전성에 대한 반복적인 질문이 발생합니다. 분명히 액체가 유출될 수 있고 고체 매체는 그러한 위험을 수반하지 않으며, 마이코박테리아의 현탁액을 다룰 때 에어로졸화의 위험도 있기 때문에 이것은 이해할 수 있는 두려움입니다. 실제로 이러한 이유 때문에 mod 방법론이 간접 약물 감수성 테스트가 필요한 어떤 방법론보다 더 안전한 방법론이라고 믿습니다.

그 이유는 간접 감수성 테스트의 경우 알려진 농도의 미생물 농도를 현탁액으로 준비하기 때문입니다. 따라서 여기에는 유출 및 에어로졸화의 모든 부수적인 위험이 있는 고농축 미생물 용액의 조작이 포함됩니다. 대조적으로, mods 방법론은 이제 보시다시피 단순히 가래 샘플을 플레이트에 접종한 후 플레이트를 비닐 봉지에 밀봉하는 것입니다.

이 백은 다시는 열리지 않으므로 이러한 고농축 현탁액을 처리할 필요가 없습니다. 그렇다고 해서 모드 방법론이 완전히 안전하다고 믿는 것은 아니며, 마이코박테리아를 다루는 것은 항상 위험을 수반합니다. 하지만 2006년에 발표된 한국의 자료는 모드가 다른 문화를 도금하는 것보다 더 위험하지 않다는 우리의 입장을 입증하는 것처럼 보였습니다.

이 연구는 실험실 작업자를 대상으로 수행된 연구로, 배양을 배양하고 약물 감수성 검사에 대한 책임이 없는 실험실 작업자의 직업적 위험이 객담 도말 현미경 검사를 하는 작업자의 직업적 위험보다 크지 않다는 것을 보여주었습니다. 이와는 대조적으로, 마이코박테리아의 현탁액을 다루고 약물 감수성 검사를 하는 사람들은 결핵에 대한 직업적 위험률이 훨씬 더 높습니다. 분명히, 모든 분만 실험실 직원이 가능한 한 최대한의 보호를 받는 것이 가장 중요하며, 따라서 우리는 N95 표준 마스크를 의미하는 적절한 개인 호흡기 보호구 없이는 이러한 절차를 수행하지 않을 것을 강력히 권장합니다.

또한 모든 배기 영역이 HEPA 필터를 통해 여과되는 2급 생물 안전 캐비닛 또는 후드가 필요합니다. 마지막으로, 실험실 내 공기 흐름의 난기류를 방지하는 데 매우 중요한 간단한 메커니즘은 샘플이 처리되는 동안 직원의 출입을 막기 위해 실험실 문을 잠그는 것입니다. 이렇게 하면 실험실 내 전염 위험을 줄일 수 있으므로, mods 방법론이 무엇을 포함하는지, 자원이 제한되어 있지만 고품질 TB 및 MDR TB 진단이 시급히 필요한 환경에서 얼마나 유용할 수 있는지에 대한 좋은 개요가 제공되기를 바랍니다.

자세한 내용은 당사 웹사이트, mods peru. org를 방문하여 자세한 표준 운영 절차와 모드 사용자 가이드를 찾을 수 있습니다. 추가 폐 샘플 처리를 위한 SOP 외에도 마이코박테리움 및 결핵, 기타 마이코박테리아 및 박테리아 및 곰팡이 오염에 대한 사진 라이브러리도 보유하고 있으며, 품질 보증 전략과 mods 사용을 시작하기 위해 실험실 인증을 위해 권장하는 절차도 찾을 수 있습니다.

마지막으로, 자주 묻는 질문 시트가 있으며, 이는 반복적인 방법론이므로 현재 모드를 사용하고 있는 사용자의 피드백을 환영합니다. 앞서 설명했듯이 이 검사는 비독점 검사이며 우리는 항상 다른 실험실에서 만든 개선 사항에 관심이 있습니다.