Baculovirus과 Lepidopteran 애벌레의 구강 감염 프로토콜

이 비디오에서는, 우리는 insecticidal 효율성을 결정하기 위해 baculovirus와 lepidopteran 유충의 경구 감염 기법을 보여줍니다.

Vao 바이러스는 단백질 발현을 위해 곤충 세포주와 함께 사용되는 DNA 벡터로 일반적으로 사용됩니다. 그러나 이 바이러스가 곤충을 효과적으로 감염시켜 치명적인 결과를 초래한다는 사실은 또한 효과적인 살충제입니다. 예를 들어, 브라질에서는 야생형 발로 바이러스가 매년 100만 헥타르 이상의 콩 작물에 살충 효능을 높이기 위해 벨벳콩 애벌레를 방제하기 위해 살포되고 있으며, 발로 바이러스는 곤충의 HemosIL 내에서 활성을 가진 곤충 특이적 독소를 암호화하는 유전자로 유전자 조작되었습니다.

이 비디오에서는 살충 효능을 분석하기 위해 나비목 유충을 바카오 바이러스에 구강 감염시키는 방법을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 안과와 아이오와 주립 대학의 Blind Boning 실험실에서 왔으며 뼈 실험실의 Wendy Sparks입니다. 오늘은 리터와 유충의 VA 바이러스 감염에 대한 두 가지 절차를 보여 드리겠습니다.

먼저 harran은 비말 공급 생물 검정을 사용하여 신생아 유충을 감염시키는 방법을 보여줄 것입니다. 그런 다음 다이어트 혈액 생물학적 분석을 사용하여 중후반 instar 유충을 감염시키는 방법을 보여 드리겠습니다. 시작하겠습니다.

액적 공급 생물 검정은 아바카비르의 치사량과 생존을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 발로 바이러스에 감염된 유충의 시간. 일반적으로 이 분석에는 초기 instar 또는 신생아 유충이 사용됩니다.

시작하기 전에, 적절한 다이어트가 가능한 다이어트 컵을 가지고 있는지 확인하세요. 또한, 적절한 바이러스 희석액을 준비하고, 녹색 식용 색소 염료를 4 부피 농도로 희석한다. 치명적인 바이러스 농도를 결정하기 위해, 희석은 1에서 99 % 사이의 사망 범위를 제공해야합니다 다면체의 침전을 방지하기 위해 튜브를 와류 한 후 적절한 바이러스 농도 범위를 결정하기 위해 예비 생물학적 분석이 필요할 수 있습니다., 60 밀리미터 페트리 접시에 바이러스 용액의 작은 방울의 두 개의 동심원 원을 만듭니다.

사용된 바이러스의 각 농도에 대해 음성 대조군 모의 감염도 설정하는 것을 잊지 마십시오. 치료 다음으로, 25-30 마리의 신생아 유충을 멸균 붓을 사용하여 동심원 중앙으로 옮깁니다. 접시에 뚜껑을 덮고 유충이 탈출하지 않도록 파라폼으로 밀봉합니다.

이상적으로는 처리 간 오염을 방지하기 위해 각 바이러스 유형으로 옮기기 위해 다른 페인트 브러시를 사용하는 것이 좋습니다. 접시를 실온에 10-15분 동안 그대로 두면 유충이 물을 마십니다. 먹이를 먹은 용액 유충은 녹색 식용 염료로 인한 전방 내장의 녹색 착색으로 식별 할 수 있으며, 다이어트가 들어있는 1 온스 플라스틱 컵에 먹이를 먹은 유충 만 컵당 1 마리의 유충을 옮깁니다.

유충을 옮긴 후 컵을 뚜껑으로 덮고 감염 후 24시간 후에 섭씨 28도에서 배양합니다. 죽은 유충이 들어 있는 컵을 제거하십시오. 이러한 조기 사망은 취급 부상으로 인한 것일 수 있습니다.

이 생물학적 분석을 사용하여 치사량을 결정할 때, 모의 감염된 유충과 살아남은 바이러스 처리된 유충이 정제되거나 빌려오기 시작할 때까지 유충을 2-3일마다 확인해야 합니다. 번데기를 위해 바이러스에 감염된 유충은 먹이 위에 남아 있다가 며칠 후에 죽습니다. 죽은 유충은 때때로 감염으로 죽는 검게 변하는 유충은 본질적으로 다면체 주머니가 되어 완전히 용해됩니다. 이때 기계적으로 방해를 받으면 각 처리에서 유충 폐사율을 점수화하십시오.

치사량 농도 생물 검정은 별도의 경우에 3회 또는 4회 복제해야 합니다. 각 바이러스 또는 대조군 치료에 대해 용량당 30명을 사용합니다. polo 또는 SAS와 같은 적절한 유언 검인 분석 프로그램을 사용하여 lc 50 값, 95% 신뢰 구간 및 적절한 통계를 계산합니다.

이 액적 공급 분석은 ST 50 생존 시간 값을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 경우 유충 사망률은 4-8시간마다 더 빈번한 관찰로 점수가 매겨집니다. 사망률이 높은 경우, 생존 시간 중앙값을 lc 99 용량의 바이러스 중앙값을 사용하여 생물학적 분석을 수행하고, 95% 신뢰 한계는 s plus 또는 SAS 프로그램을 사용하여 Kaplan Mayer 추정기를 사용하여 계산합니다.

이제 Harang이 물방울 공급 생물 검정을 보여 주었으므로 다이어트 플러그 생물 검정에서 다이어트 플러그 생물 검정을 보여 드리겠습니다. 중후반의 Instar 유충은 이 분석을 수행하기 전날 치사량 또는 LD 50을 결정하기 위해 알려진 용량의 바이러스로 처리된 다이어트 플러그를 먹습니다. 컵에서 식단을 제거하여 유충을 밤새 굶주리게 하십시오.

이 단계는 유충이 바이러스를 섭취하는 속도를 증가시킵니다. 다음날 다이어트 큐브를 접종하고 약 2입방밀리미터의 작은 입방체로 잘라 다이어트를 준비합니다. 다이어트 큐브가 너무 작으면 건조해집니다.

다이어트 큐브가 너무 크면 유충이 하룻밤 사이에 다이어트 큐브 전체를 섭취할 수 없습니다. 이제 각 다이어트 큐브에 1-2마이크로리터의 다면체 현탁액을 추가합니다. 현탁액에는 4%x 부피의 식용 색소 염료가 포함되어 있습니다.

현탁액이 5-15분 동안 다이어트에 스며들도록 합니다. 또한 모의 바이러스로 처리된 다이어트 큐브를 음성 대조군으로 준비하는 것을 잊지 마십시오. 다음으로, 각 컵에 있는 각 네 번째 instar 유충에게 하나의 다이어트 큐브를 옮깁니다.

그런 다음 다음날 섭씨 28도의 인큐베이터에 컵을 하룻밤 동안 넣고 다이어트 큐브를 완전히 먹지 않은 유충은 버리십시오. 그런 다음 남은 유충을 위해 각 컵에 큰 식단을 추가하십시오. 유충을 섭씨 28도로 유지하고, 모의 감염된 유충과 살아남은 바이러스에 감염된 유충이 먹거나 번데기를 시작할 때까지 필요에 따라 추가 식단을 추가합니다.

이때 죽은 곤충과 살아남은 곤충의 수를 기록하십시오. 곤충을 등 바이러스로 감염시키는 두 가지 방법, 출혈, 섭식 생검 및 다이어트 플라크 생검을 보여드리겠습니다. 이 절차를 수행할 때 유충을 죽인 시체는 일반적으로 취약하고 바이러스를 방출하여 쉽게 파열될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 작업 표면을 살균하고 오염된 장갑과 일회용품을 적절한 방식으로 폐기하여 오염을 방지하십시오. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.