Baculovirus과 Lepidopteran 애벌레의 Microapplicator를 이용한 감염 프로토콜

절지동물 특이적 바큘로바이러스(baculovirus)는 진핵세포 단백질 발현 시스템을 위한 표준 연구 도구로 사용될 뿐만 아니라, 자연계의 나비목과 같은 초식 곤충을 사멸시킬 수 있는 환경 친화적인 살충제로도 개발되고 있습니다. 나비목 유충은 감염된 잎을 먹을 때 바큘로바이러스에 감염됩니다. 유충 또는 애벌레는 다면체(polyhedron)라고 알려진 형태로 바큘로바이러스를 섭취하는데, 이는 바이러스를 건조로부터 보호하는 거대한 결정성 단백질 구조 내에 바이러스 입자들이 포장된 복합체입니다.

유충이 감염되면, 침입한 바이러스가 곤충 내부로 감염을 확산시킵니다. 바이러스는 호스트의 핵산 및 단백질 합성 기전을 가로채어 더 많은 바이러스와 다면체를 생성합니다. 결과적으로 유충은 바이러스에 매우 심하게 감염되어 다면체의 끈적한 액체 상태로 녹아내리며, 이것이 곤충이 섭식하는 식물 표면에 떨어지면서 사이클이 다시 시작됩니다. 이는 특정 Baca의 살충 효능을 결정하기 위함입니다.

Avir 균주 마이크로 어플리케이터 기술과 바이오어세이를 결합하여 사용할 수 있습니다. Leid dorin 유충의 HemosIL 또는 체강에 바이러스를 직접 주입하여 감염시킨 후 사망률을 평가할 수 있습니다. 또한, 구강 마이크로 어플리케이터 보조 주입법을 사용하여 유충에 polyhedra를 감염시킬 수 있으며, 장 및 기타 조직의 감염 시점을 분석할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 아이오와 주립대학교 곤충학과의 Brian e boning 연구실에 소속된 Wendy Sparks이며, boning snap에서도 활동하고 있습니다. 오늘은 실험실 사육 오리(lab duck DI)를 백로그 바이러스(backlog virus)로 감염시키는 두 가지 절차를 보여드리겠습니다. 두 방법 모두 마이크로 어플리케이터(micro applicator)를 사용합니다.

먼저, 마이크로 어플리케이터를 사용하여 프로브를 통해 헤니에 바디 바이러스를 주입하는 방법을 보여드리겠습니다. 그다음, 마이크로 어플리케이터를 사용하여 마우스의 입을 통해 미드 가드에 폴리 헤더를 주입하는 방법을 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

살충 목적으로 개발될 때, balo 바이러스는 보통 해충 유충의 경구 감염을 용이하게 하기 위해 polyhedron 유전자를 포함합니다. 하지만 때로는 polyhedron 음성 baccala 바이러스의 잠재적 살충 효과를 테스트하거나 곤충의 장을 우회해야 할 이유가 있습니다. 이 경우, 분석을 시작하기 전 마이크로 어플리케이터를 사용하여 버티드 바이러스를 주입함으로써 유충을 감염시킬 수 있습니다.

접종용 바이러스 working stock의 역가는 플라크 분석법(plaque assay) 또는 종말 희석 분석법(endpoint dilution assays)을 사용하여 결정해야 합니다. 생리학적 실험의 경우, 5령 H VNS당 5 × 10⁴ PFU를 주입하는 것이 일반적입니다. 이 생물학적 분석을 시작하려면, 각 단계별로 희석된 접종용 바이러스를 28.5 또는 32 gauge 샤프 니들 팁이 장착된 1 cc 플라스틱 헐큐(hercule) 시린지에 충전하십시오.

일반적으로 1mL당 10⁷~10⁸의 타이터(titer)를 가진 희석된 바이러스 용액을 유충당 1~3µL 사용하며, 대부분의 경우 시린지에 300~500µL를 충전하는 것으로 충분합니다. 그다음, 시린지를 수직으로 세워 공기가 바늘 끝으로 모이게 한 뒤 배출하여 시린지 내부의 기포를 제거합니다.

그 다음 시린지를 시린지 지지 튜브에 고정합니다. 이제 부피를 1.0 µL로 설정하십시오. 마이크로 어플리케이터의 마이크로프로세서 제어 장치에서 각 액적에 대해, 먼저 제어 장치를 보정하여 정확한 부피가 분주되는지 확인하십시오. 액적이 분주되는 속도는 0에서 9까지의 단계로 설정할 수 있습니다.

일반적으로 0에서 1 사이의 범위를 사용합니다. 풋 스위치를 눌러 용액이 적절하게 분사되는지 확인하십시오. 용액이 너무 많이 분사되거나 분사 속도가 너무 느린 경우, 적절한 양의 용액이 정확한 속도로 도포될 때까지 부피 및 속도 설정을 조정할 수 있습니다.

이제 H VNS 감염을 위한 주입을 시작하겠습니다. 일반적으로 5령 초기 유충에 주입하는데, 후기 령의 더 큰 크기가 주입 과정을 용이하게 하기 때문입니다. 바늘 끝을 가슴다리 중 하나의 발바닥(plana)을 통해 체강 내로 삽입하십시오.

참고로, 바늘 끝이 전흉절에 삽입될 때 유충의 몸 위치가 변하므로, 장과 체벽이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 풋 스위치를 네 번 눌러 4 µL의 바이러스 용액을 혈강으로 주입합니다. 주입이 완료되면 모든 유충을 28 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 죽은 유충이 있는지 자주 확인하고, 생존한 유충이 충분한 먹이를 섭취할 수 있는지 확인하십시오.

종령 유충은 주입으로 인한 큐티클 손상으로 사망하지는 않지만, 세균 감염으로 인한 장 손상이 발생할 수 있으므로 주입 24시간 후에 유충 상태를 확인해야 합니다. 이러한 조기 사망 사례는 데이터 분석에서 제외되어야 합니다. 치사 농도 생물 검정을 위해 버톤 바이러스(butted virus)를 이용한 마이크로 어플리케이터 보조 생물 검정을 수행하는 경우, 생물 검정은 서로 다른 시기에 3~4회 반복해서 실시해야 합니다.

각 바이러스 또는 대조군 처리당 용량별로 30마리의 개체를 사용하십시오. polo 또는 SAS와 같은 적절한 확률 분석 프로그램을 사용하여 LC₅₀ 값, 95% 신뢰 구간 및 적절한 통계치를 계산하십시오. 이 생물학적 분석법은 일정 용량의 바이러스를 접종한 후의 ST₅₀ 생존 시간 값을 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 사례에서는 4~8시간마다 유충의 사망률을 측정하며, 더 빈번한 관찰을 수행합니다. 사망률이 높을 경우, S-Plus 또는 SAS 프로그램을 이용한 Kaplan-Meyer 추정법을 통해 95% 신뢰 구간 내의 중앙 생존 시간을 계산합니다. 이제 Harran이 부토바이러스(butted virus)를 이용한 마이크로 어플리케이터 보조 생물검정법을 보여드렸습니다.

분석 방법을 보여드리겠습니다. 다면체(polyhedra)를 사용한 방법으로, 감염 시점이 매우 중요한 경우 다면체를 곤충의 장으로 직접 경구 접종합니다. 예를 들어, 바이러스가 곤충 내에서 어떻게 확산되는지 모니터링할 때 이 분석법을 사용합니다. 이 분석을 시작하려면 다면체를 글리세린과 물의 3:2 중성 부력 용액에 10~300 농도로 현탁시킵니다.

예를 들어, 4령 유충의 생존율을 높이기 위해 Polyhedra를 사용할 수 있습니다. 그런 다음, 이 용액을 32게이지 뭉툭한 팁 바늘이 장착된 1 CC 플라스틱 또는 유리 투베르쿨린 주사기에 충전합니다. 현미경으로 관찰하며 주사기를 마이크로 어플리케이터의 지지 튜브 위에 놓습니다.

4령 또는 5령의 star larva를 잡고, 바늘을 입을 통해 중장의 앞부분으로 삽입한 다음 polyhedra를 주입합니다. 이 기술은 어느 정도의 숙련도가 필요합니다. 우선, 장갑을 낀 상태에서 유충을 찌그러뜨리지 않고 잡는 것이 까다로울 수 있습니다.

둘째, 입 부분을 지나 바늘을 삽입하는 데에는 어느 정도의 연습이 필요합니다. 약 30마리의 유충에 PBS를 접종하며 연습하는 것을 권장합니다. 만약 실수로 장을 천자하게 되면, 유충이 매우 빠르게 멜라닌화되어 검게 변하므로 쉽게 확인할 수 있습니다.

마이크로 어플리케이터를 이용한 경구 접종은 정확한 감염 시간을 제공하므로, 바이러스가 곤충 내에서 어떻게 확산되는지를 결정하는 데 감염 시간이 중요한 실험에 이 방법이 가장 유용합니다. 예를 들어, 베타 갈락토시다아제(beta galactosidase)를 발현하는 바이러스를 유충에 경구 접종한 후, 다양한 시점에서 해부하여 어떤 조직이 감염되는지 확인할 수 있습니다. 여기서는 마이크로 어플리케이터를 이용한 두 가지 감염 방법을 보여드리겠습니다. 첫 번째는 바이러스를 전흉다리(proleg)를 통해 직접 접종하는 방법으로, 이를 통해 장의 생리적 특성을 배제하고 관심 있는 바이러스의 치사율과 치사 시간을 평가할 수 있습니다.

두 번째 기술은 다면체(polyhedra)를 사용하여 중장으로 직접 접종하는 것입니다. 이 방법을 통해 중장에 매우 정밀한 용량을 직접 전달할 수 있으며, 사건의 발생 타이밍을 매우 정밀하게 제어할 수 있습니다. 그 후 바이러스의 치사율 및 기타 표현형 또한 연구할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, baula 바이러스가 처리된 사체 유충은 일반적으로 취약하며 쉽게 파열되어 바이러스를 방출할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 작업 표면을 멸균하고, 오염된 장갑과 일회용 재료를 적절한 방식으로 폐기하여 오염을 방지하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.