Name: 시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 학습하세요 카제인 기판을 이용한 비특이적 프로테아제 활성 분석 방법을 통해 티로신 방출량을 정량화하고 흡광도 측정으로 효소 활성을 산출하는 표준화된 생화학적 분석 기법을.

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분석을 시작하기 전에, 우리는 다음의 시약이 올바르게 준비되었는지 확인해야합니다 : <ol><li> 50 MM의 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5. 11.4 MG / 칼륨 phospate 이염, 물을 정화하고 1M HCL과 산도를 조정에 trihydrate의 ML을 사용하여 준비합니다. 이 솔루션은 사용하기 전에 ° C 37 배치됩니다. </li><li> 50 MM의 칼륨 인산 버퍼에 카제인의 6.5 MG / ML을 혼합하여 준비 0.65 % 중량 / 부피 카제인 솔루션. 점차적 ° C 10 분 정도 동질적인 분산이 이루어 때까지 80-85로 부드러운 감동과 솔루션 온도를 증가. 이 솔루션을 끓여서하지 않는 것이 매우 중요합니다. NaOH와 HCL와 함께 필요한 경우 산도 그런 다음 조정됩니다. </li><li> 물을 정화와 6.1N 재고 1시 55분을 diluting하여 준비 110 MM Trichloroacetic 산성 용액. Trichloroacetic의 산성이 강한 산성이며 유의해서 다루어 져야합니다. </li><li> 0.5 MM Folin &amp; Ciolcaltea의, 또는 직접적으로 프로 테아제의 활동과 관련이있을 것입니다 측정 색 변화를 생성하는 티로신과 반응 솔루션입니다 Folin의 페놀 시약. Folin의 페놀 시약은 산성이며 유의해서 다루어 져야합니다. </li><li> 물을 정화에 anyhydrous 나트륨 탄산의 53 MG / ML을 사용 준비 500 MM 나트륨 탄산 솔루션. 37 5mM 칼슘 아세테이트 10 MM의 아세트산 나트륨 버퍼, 산도 7.5의 효소로 구성되어 희석제 솔루션 ° C. 이 솔루션은 우리가 고체 테아제 샘플을 분해 또는 효소 솔루션을 희석하는 데 사용하는 어떤 것입니다. </li><li> 1.1 MM L - 티로신 표준 재고 솔루션입니다. 물을 정화하고 티로신이 해소 때까지 부드럽게 온수 0.2 MG / ML L - 티로신을 사용하여 준비 하였다. 카제인과 마찬가지로이 솔루션을 끓여하지 않습니다. L - 티로신 표준 실온으로 냉각하도록 허용합니다. 이 솔루션은 표준 곡선을 만들기 위해 더욱 희석됩니다. </li><li> 단백 분해 효소 솔루션입니다. 사용하기 전에 즉시, 6 단계에서 준비 효소 희석제 솔루션 테아제를 해산. </li></ol> 필요한 경우, 0.1-0.2 단위 / ML하는 효소 희석액을 사용하여 해산합니다 예정된 활동의 견고한 프로 테아제 샘플을 사용합니다. 이 솔루션은 품질 관리 분석에 대한 긍정적인 제어로 우리가 효소 활동을 결정하기 위해 수행되는 계산에 대한 검증 역할을합니다. 단백 분해 효소 분석 및 표준 곡선 설정 <ol><li> 이 분석을 시작하려면 약 15 MLS를 개최합니다 적절한 튜브를 찾으십시오. 테스트 각 효소에 대한 4 튜브가 필요합니다. 한 병에가 빈로 사용되며, 세 사람은 프로 테아제의 세 dilutions의 분석 활동하는 데 사용됩니다. 서로에 대한 최종 계산을 확인할 때 세 dilutions가 유용합니다. <ol><li> 네 튜브의 각 설정하려면, 우리의 0.65 %의 카제인 솔루션의 5mls를 추가합니다. 그들이 37 물 목욕으로 평형하자 ° C를 약 5 분하십시오. </li><li> 공백이 아닌 테스트 샘플 튜브 세 가지로 테스트됩니다 효소 솔루션의 볼륨을 변화하지만, 추가합니다. ° C 정확히 십분을 휘몰아치는 37에 대한 부화하여 섞는다. 이 배양 시간 동안 프로 테아제의 활동과 티로신의 결과적 해방은 측정 및 테스트 샘플 사이에 비교 될거야. </li></ol></li><li> 이 10 분 부화 후, 반응을 중지 각 튜브에 TCA 시약의 5​​ MLS를 추가합니다. 그런 다음, 각 튜브에 심지어 빈, 그래서 각각의 튜브에 효소 용액의 최종 부피가되는 한 ML을 효소 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 이것은 효소 자체의 흡광도 값을 고려하여 각 튜브의 최종 볼륨이 동일한지 확인하는 일을합니다. 37 솔루션을 품어 ° C를 30 분. 이 30 분 동안 부화, 당신은 티로신 표준 dilutions을 설정할 수 있습니다. 쉽게 팔 MLS를 저장할 수있는 6 DRAM 튜브 (DRAM의 튜브가 폴리 프로필렌 튜브로 대체 수 있습니다)를 사용합니다. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50 : 여섯 튜브하려면, MLS에서 다음 볼륨으로 1.1 MM 티로신 표준 재고 솔루션을 추가합니다. 빈 어떤 티로신 표준을 추가하지 마십시오. 낮은 표준은 약간의 색상 변화를 얻을 것입니다 불순한 테스트 샘플에 필요한 수 있습니다. 티로신 표준 솔루션이 추가되면, 2 MLS에 볼륨을 가져 기준 각 정화 물을 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 30 분 부화 후, 테스트 솔루션의 각 필터와 빈이 0.45 음 polyethersulfone 주사기 필터를 사용합니다. 여과는 시료로부터 insolubles를 제​​거하는 데 필요합니다. <ol><li> 최소한 8 MLS를 저장할 수있는 4 DRAM의 튜브로 여과 2 테스트 샘플의 MLS와 빈 여과물을 추가합니다. 기준가 준비가되어있는 유리병의 동일한 유형을 사용하실 수 있습니다. </li><li> 기준 및 표준 공백이 들어있는 유리병 모든, 나트륨 탄산염의 5mls를 추가합니다. 최상의 결과를 얻으려면, 즉시 나중에 Folin의 시약 1 ML를 추가합니다. </li><li> Folin의 시약을 추가하여 만든 산도 드롭을 규제하기 위해 나트륨 탄산염을 추가합니다. </li><li> 테스트 샘플 드디어으로 나트륨 탄산 추가t 비워. 이러한 솔루션은 나트륨 탄산염의 추가 후 흐림된다. 무료 티로신과 주로 반응 Folin의 시약을 추가합니다. </li><li> 소용돌이 치는하여 DRAM의 튜브를 섞어 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 이 부화 후, 당신은 표준 티로신 추가의 금액과 연관 색상의 그라데이션이 있다고 통지해야한다 티로신의 최고 농도는 어두운 게재. 당신은 또한 우리의 테스트 샘플에서 감지할 수있을 정도의 색상 변경을 통지하실 수 있습니다. 이러한 솔루션 2mls는 적합한 cuvettes에 0.45 음 polyethersulfone 주사기 필터를 사용하여 필터링됩니다. 분석이 수행되는 이제, 당신은 우리의 흡광도 값을 기록 분광 광도계로 진행할 수 있습니다. </li></ol> 흡광도를 측정하고 효소 활동을 계산 <ol><li> 샘플의 흡광도는 660nm의 파장을 사용하여 분광 광도계로 측정됩니다. 조명 경로는 1cm로 설정됩니다. 표준, 표준 빈, 다른 시험 샘플 테스트 비워에 대한 흡광도 값을 기록합니다. 일단 모든 데이터가 수집되어, 표준 곡선을 만들 수 있습니다. 표준 및 표준 빈 사이의 흡광도의 곡선을 생성하기 위해 차이는 계산해야합니다. 이것은 표준 솔루션 티로신의 양에 기인 흡광도 값이다. 이 간단한 계산 후, Y 축에 대한 기준 흡광도의 변화, 대 X 축에 대한 다섯 표준의 각 micromoles에 금액을 계획하는 그래프 프로그램을 사용하여 표준 곡선을 만듭니다. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> 티로신 표준의 볼륨 </th><th style="text-align:center"> uMoles의 티로신 </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li> 데이터 포인트가 입력되고 나면, 가장 적합한 및 해당 슬로프 방정식의 라인을 생성합니다. 테스트 샘플 흡광도 및 테스트 빈의 흡광도의 차이를 계산하여 테스트 샘플의 흡광도 변화를 찾으십시오. 슬로프 방정식에 테스트 샘플 중 하나에 대한 흡광도 값을 삽입 및 해결하면이 특정 proteolytic 반응 동안 티로신 해방의 micromoles가 발생합니다. / ML 당 단위로 효소의 활동을하려면, 다음과 같은 계산을 수행합니다 : (umole 티로신 등가물이 발표) X (11) 단위 / ML 효소 = __________________________________________ (1) X (10) X (2) 분석 11 = 총 볼륨 (밀리리터)을 분석 10 = 시간 (분)을 단위로 정의 당 한 효소의 효소 = 볼륨 (밀리리터)를 사용 Colorimetric 결정에 사용되는 2 = 볼륨 (밀리리터)을 슬로프 방정식에서 얻은 micromoles 티로신 동일한 릴리스의 개수를 가지고 우리의 경우에는 11mls있다 MLS에서 분석의 총 볼륨에 의해 그것을 곱하면됩니다. 세 가지 다른 수량하여이 값을 나누기 : 우리가 10 분 동안 실행된 분석의 시간, 분석에 사용되는 효소의 볼륨은, (가 1ml를 사용하자) 다양한되었던 colorimetric 검출에 사용 밀리리터의 부피, 어떤 수 있습니다 귀하의 쿠베트에 따라 다릅니다. 우리는 MLS 2를 사용합니다. </li><li> 티로신의 Micromoles는 &quot;단위&quot;라는 단백 분해 효소 활동의 분 수율 측정 시간으로 나눠 계산합니다. 우리는 단위 / ML의 관점에서 효소 활동의 measurment두고, 분자와 분모의 볼륨 측정 단위를 취소할 수 있습니다. 효소 희석액에 희석 솔리드 프로 테아제 샘플의 활동을 결정하기 위해, 우리는 단위 / MG의 관점에서 활동으로 우리를 떠나지에서 MG / ML. 원래이 분석에 사용되는 고체의 농도에 의해 단위 / ML 우리의 활동을 나누어 . 단위 / ML 효소 단위 / MG 고체 = _____________________ MG 솔리드 / ML 효소 </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

우리는 시그마의 보편적인 프로 테아제 활동 분석을 사용하는 프로 테아제 활동을 분석하는 방법을 보여했습니다. 또한,이 분석은 실험을 위해 그들을 받게하기 전에 우리 프로 테아제는 정확하게 활동을 결정했는지 확인하는 데 유용합니다. 당신이 본 것처럼,이 절차를 수행할 때, 그것은 천천히 아니라 그들을 끓일 수있는 카제인과 티로신 솔루션을 모두 열을 기억 파라마운트 중요 하군요. 또한, 둘 다 표준과 당신이 가진 각 테스트 샘플에 대해 서로 다른 공백을 준비하는 매우 중요하다.

<table><tbody><tr><td>프로테아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>인산수소칼륨 삼수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>카제인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>폴린 &amp;Ciocalteu의 페놀 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>무수 탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 삼수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-티로신, 유리 염기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 프로파일러 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 형광 검출 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

프로 테아제는 펩티드 채권을 깰. 연구실에서, 그것은 종종 프로 테아제의 활동을 측정 및 / 또는 비교하는 것이 필요합니다. 시그마의 불특정 프로 테아제 활동 분석은 우리의 품질 관리 절차 동안 어떤 일을 프로 테아제의 활동을 결정하는 표준화된 절차로 사용할 수 있습니다. 이 분석에서는 카제인은 기판 역할을합니다. 우리가 테스트하는 프로 테아제가 카제인 소화되면 아미노산 티로신은 다른 아미노산과 펩타이드 조각과 함께 해방됩니다. Folin 및 Ciocalteus 페놀, 또는 Folin의 시약은 주로 같지는와 분광 광도계에 흡광도 값으로 측정하는 파란 색깔의 발색단를 생산하는 무료 티로신과 반응. 카제인에서 릴리스 더 티로신, 더 chromophores이 프로 테아제의 활동을 생성하고 강한입니다. 단백 분해 효소의 활동에 의해 생성된 흡광도 값 micromoles에서 티로신의 양을와 흡광도의 변화를 상호 연관시킬 FC 시약과 티로신 알려진 수량 반응에 의해 생성된 표준 곡선에 비교됩니다. 표준 곡선에서 프로 테아제 샘플의 활동은 분당 카제인에서 출시 티로신 등가물의 micromoles에서 금액 단위의 측면에서 결정 수 있습니다. 중국어로이 문서를 보려면 <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">여기를 클릭하십시오</a>

프로 테아제는 펩티드 채권을 깰. 연구실에서, 그것은 종종 프로 테아제의 활동을 측정 및 / 또는 비교하는 것이 필요합니다. 시그마의 불특정 프로 테아제 활동 분석은 프로 테아제의 활동을 결정하는 표준화된 절차로 사용할 수 있습니다.

프로테아제(Proteases)는 펩타이드 결합을 분해합니다. 실험실에서는 종종 프로테아제의 활성을 측정하거나 비교해야 할 필요가 있습니다. Sigma의 비특이적 프로테아제...

프로테아제는 실험실에서 펩타이드 결합을 분해합니다. 프로테아제의 활성을 측정하거나 비교하는 작업이 자주 필요하며, Sigma의 범용 프로테아제 활성 분석법은 프로테아제 활성을 결정하기 위한 표준 절차로 사용될 수 있으며, 이는 당사의 품질 관리 과정 중에 수행되는 작업입니다.본 분석법에서 Casian은 테스트 대상인 프로테아제가 casian을 소화할 때 기질로 작용합니다. 이때 아미노산 tyrosine이 다른 아미노산 및 펩타이드 조각들과 함께 유리됩니다. 유리된 tyrosine은 fallen 및 cyl cals phenol 또는 fallen 시약과 반응하여 청색의 발색단을 생성하며, 이는 정량화가 가능하며 분광광도계를 통해 흡광도 값으로 측정됩니다.카제인에서 더 많은 티로신이 방출될수록 더 많은 발색단이 생성되며 프로테아제의 활성이 더 강해집니다. 프로테아제 활성에 의해 생성된 흡광도 값은 알려진 양의 티로신을 FC 시약과 반응시켜 흡광도 변화를 상관관계화하여 생성한 표준 곡선과 비교합니다. 표준 곡선을 통해 마이크로몰 단위의 티로신 양을 구함으로써, 프로테아제 시료의 활성을 분당 카제인에서 방출된 티로신 당량의 마이크로몰 양인 단위(unit)로 결정할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 미주리주 세인트루이스에 있는 Sigma Aldridge DeKalb 시설의 과학자 Carrie Cup Vineyard입니다.오늘은 Sigma Aldridge에서 프로테아제 활성을 테스트하는 보편적으로 적용 가능한 방법을 보여드리겠습니다. 저희는 주로 품질 관리 구역에서 이 분석법을 사용하여, 귀하의 실험실로 제품을 직접 배송하기 전에 프로테아제가 충분한 활성을 가지고 있는지 확인합니다. 분석을 시작하기 전에 다음 시약들이 올바르게 준비되었는지 확인해야 합니다.pH 7.5의 50 millimolar 인산칼륨 완충액을 준비합니다. 사용 전 용액을 37 °C로 유지하며, 1L당 6.5 mg/mL를 혼합하여 제조한 0.65% w/v 카제인 용액을 첨가합니다. 용액의 온도를 부드럽게 교반하며 80~85 °C까지 서서히 높여, 균질한 분산 상태가 될 때까지 약 10분간 유지합니다.용액을 끓이지 않는 것이 매우 중요합니다. 그 후 필요에 따라 수산화나트륨과 염산을 사용하여 pH를 조절합니다. 6.1 N 스톡 용액을 정제수로 1:55 비율로 희석하여 준비한 110 mM 트리클로로아세트산 용액과, 티로신과 반응하여 측정 가능한 색 변화를 일으키는 용액인 0.5 mM 폴 로우앤-실 칼츠(Folin-Lowy and Seal Calts) 또는 폴 로우앤-페놀(Folin-Phenol) 시약을 사용합니다.이는 프로테아제(protease)의 활성과 직접적으로 관련이 있습니다. 정제수에 무수 탄산나트륨 53 mg/mL를 사용하여 조제한 500 mM 탄산나트륨 용액과, 37 °C에서 5 mM 칼슘이 포함된 10 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 7.5)으로 구성된 효소 희석액을 준비합니다. 이 용액들을 고체 프로테아제 시료를 용해하거나 효소 용액을 희석하는 데 사용합니다.초기 농도가 1.1 millimolar인 L tyrosine 표준 스톡 용액(L tyrosine 0.2 milligram/mL 용액)은 정제수에 조제하며, tyrosine이 용해될 때까지 부드럽게 가열합니다. casein과 마찬가지로, 이 용액을 끓이지 마십시오. L tyrosine 표준 용액을 실온까지 식힙니다.필요한 경우, 이 용액을 추가로 희석하여 표준 곡선을 작성합니다. 미리 활성도가 결정된 고체 프로테아제 샘플을 효소 희석액을 사용하여 0.1~0.2 units per milliliter 농도로 용해합니다. 이 용액은 품질 관리 분석을 위한 양성 대조군으로 사용되며, 효소 활성을 결정하기 위해 수행할 계산의 검증 자료로 활용됩니다. 시약을 모두 준비하고 적정 온도에 맞추었으므로, 이제 프로테아제 분석을 시작하겠습니다.이 분석을 시작하려면 약 15 밀리리터를 담을 수 있는 적절한 바이알을 준비하십시오. 테스트할 각 효소마다 4개의 바이알이 필요합니다. 바이알 하나는 공시료(blank)로 사용하고, 나머지 세 개는 세 가지의 활성을 분석하는 데 사용합니다.프로테아제 희석액 세 가지를 사용하여 최종 계산 결과를 서로 대조하는 것이 유용합니다. 4개의 바이알 세트 각각에 0.65% casein 용액 5 mL를 넣고 37 °C 항온수조에서 약 5분 동안 평형을 맞춥니다. 그 후, 공시료(blank)를 제외한 3개의 시험 시료 바이알에 서로 다른 농도의 효소 용액을 첨가합니다. 가볍게 흔들어 섞은 후 37 °C에서 정확히 10분 동안 배양합니다.이 배양 시간 동안의 프로테아제 활성과 그로 인한 티로신 방출량을 측정하여 시험 샘플 간에 비교합니다. 10분간의 배양 후, 각 튜브에 TCA 시약 5 mL를 첨가합니다. 그다음, 각 튜브(공시료 포함)에 효소 용액의 최종 부피가 1 mL가 되도록 적절한 부피의 효소 용액을 첨가합니다.이는 효소 자체의 흡광도 값을 고려하기 위함입니다. 이제 용액을 30 °C에서 30분 동안 배양하십시오. 이 30분 배양 시간 동안, 6개의 DR 바이알을 사용하여 티로신 표준 희석액을 준비하시기 바랍니다.여기에 8mL를 충분히 담을 수 있는 6개의 바이알이 있습니다. 1.1mM tyrosine 표준 용액을 각각 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5mL의 부피로 첨가합니다. 공시료(blank)에는 tyrosine 표준 용액을 넣지 마십시오.색 변화가 거의 없는 IPU 테스트 샘플의 경우에는 더 낮은 농도의 표준 용액이 필요할 수 있습니다. 티로신 표준 용액을 첨가한 후, 각 표준 용액에 정제수를 적절한 양으로 첨가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 배양 후, 각 테스트 용액과 공시료(blank)를 여과합니다.0.45 micron 시린지 필터를 사용하여, 테스트 시료와 공시료 여과액 2 mL를 최소 8 mL까지 담을 수 있는 DR 바이알 4개에 각각 넣습니다. 표준물질을 조제할 때 사용한 것과 동일한 유형의 바이알을 사용할 수 있습니다. 모든 표준물질 및 표준 공시료 바이알에 탄산나트륨 5 mL를 첨가하고, 최적의 결과를 위해 즉시 팔론 시약을 첨가합니다. 그 다음, 테스트 시료와 테스트 공시료에 탄산나트륨을 첨가합니다. 탄산나트륨을 첨가하면 이 용액들이 뿌옇게 흐려지는 것을 확인할 수 있습니다.그 다음, 유리 티로신과 반응하는 fallen 시약을 첨가합니다. 이후 DRAM 바이알을 회전시켜 혼합하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 티로신 첨가량에 따라 표준 시료들의 색상이 단계적으로 변화하며, 티로신 농도가 가장 높을수록 색이 가장 진하게 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.테스트 샘플에서 뚜렷한 색상 변화를 확인할 수 있습니다. 이 용액 2 mL를 0.45 micron 시린지 필터와 적절한 큐벳을 사용하여 여과합니다. 이제 분석이 완료되었으므로, 분광광도계로 이동하여 흡광도 값을 기록하겠습니다.분광광도계를 사용하여 660 nanometers의 파장에서 샘플의 흡광도를 측정합니다. 광로 길이를 1 cm로 설정하고, 표준 물질, 표준 블랭크, 다양한 테스트 샘플 및 테스트 블랭크의 흡광도 값을 기록합니다. 모든 데이터 수집이 완료되면 표준 곡선을 작성할 준비가 된 것입니다.곡선을 생성하기 위해 표준물질과 표준 블랭크 간의 흡광도 차이를 계산해야 합니다. 이는 표준 용액 내 tyrosine 양에 기인한 흡광도 값입니다. 간단한 계산 후, Y축에는 표준물질의 흡광도 변화를, X축에는 다섯 가지 표준물질 각각의 마이크로몰(µmol) 양을 플롯하여 표준 곡선을 작성합니다.데이터 지점을 모두 입력한 후 최적 적합선을 생성합니다. 그다음 테스트 샘플의 흡광도와 테스트 공시료의 흡광도 차이를 계산하여 테스트 샘플의 흡광도 변화량을 구합니다. 표준 곡선을 참조하여 Y축에서 테스트 샘플 중 하나의 흡광도 값을 확인합니다. 이제 X축과 평행하게 선을 그려 표준 곡선과 만나는 지점에서 멈춥니다.그런 다음 이 지점에서 얻은 X 좌표를 통해, 해당 단백질 분해 반응 동안 방출된 티로신의 양과 마이크로몰(µmol) 수를 알 수 있습니다. 밀리리터당 유닛(units per milliliter)으로 효소 활성도를 구하려면 다음과 같이 계산하십시오. 표준 곡선에서 얻은 방출 티로신 당량의 마이크로몰 수에 분석법의 총 부피인 11 mL를 곱합니다. 그런 다음 이 값을 다른 세 가지 수치로 나눕니다.분석 시간은 10분 동안 진행하였으며, 분석에 사용된 효소의 부피는 다양하게 조절하였습니다. 여기서는 1 mL를 사용하겠습니다. 비색 검출에 사용되는 mL 부피는 사용하시는 Qvet에 따라 다를 수 있습니다.2 mL를 사용합니다. 티로신(tyrosine)의 마이크로몰(µmol) 수를 분 단위 시간으로 나누면, '단위(unit)'라고 부르는 프로테아제 활성 측정값이 산출됩니다. 분자와 분모에서 부피 측정 단위를 상쇄하면, 결과적으로 mL당 단위(unit/mL)로 표시되는 효소 활성 측정값이 남게 됩니다.효소 희석액에 희석된 고체 프로테아제 샘플의 활성을 결정하기 위해, 밀리리터당 단위(units per milliliter)로 계산된 활성을 본 분석에 처음 사용된 고체의 농도(mg/mL)로 나눕니다. 이렇게 하면 밀리그램당 단위(units per milligram)로 된 활성 값이 산출됩니다. 지금까지 Sigma의 범용 프로테아제 활성 분석법을 사용하여 프로테아제 활성을 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 본 절차를 수행할 때 확인하셨듯이, 카제인과 티로신 용액 모두를 천천히 가열하고 끓지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.또한, 표준물질과 각각의 테스트 샘플 모두에 대해 서로 다른 블랭크를 준비하는 것이 매우 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 프로테아제 활성 측정 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백 분해 효소 형광 탐지 키트는 fluorometry를 사용하는 프로 테아제 활동의 측정을 위해 설계되었습니다. 그것은 또한 프로 테아제 오염 성분의 검출에 적합합니다. 방법은 FITC - 카제인 표시 기판의 독자적인 배합의 proteolytic hydroysis을 기반으로합니다.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

우리는 적용 레이블이없는 운동 특성을 통해 papain 여러 cystatin B로 돌연변이의 바인딩의 구조 - 기능 분석을위한 Biacore의 X100을 사용하여 단백질 상호 작용 분석. 보정이없는 농도 분석 (CFCA)는 표준 곡선을위한 필요없이 유지 바인딩 활동으로 단백질의 농도를 측정합니다. 우리는 CFCA의 운동 분석의 신뢰성을 증가하고 운동 상수가 안정적으로 재조합 단백질의 활동이 감소하더라도 확인할 수 있습니다 사용하는 농도의 확인을 보여줍니다.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

이 비디오는 트랜스듀서 칩에 고정된 표적 항원과 항체의 상호 작용을 연구하기 위한 전도도 측정 바이오센서 분석을 보여줍니다. 바이오센서는 고정되지 않은 표적 항원에 결합하기 위해 나노바디에 융합된 기능적 촉매 부위가 있는 β-락타마제 효소인 이중 기능 키메라 단백질을 갖도록 설계되었습니다. 결합시 β-락타마제 효소에 의한 항생제 기질의 촉매 가수분해는 전기 신호를 생성하여 항원-항체 상호 작용을 확인합니다.

단백질-단백질 상호작용을 위한 β-Lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay

이 비디오는 형광 펩타이드를 사용하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 프로테아제는 펩타이드의 절단 부위를 인식하여 절단하고 형광단에서 소광체를 분리하여 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 검출하고 분석하여 다양한 펩타이드 변이체의 분할 효율을 확인합니다.

프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

이 비디오는 형량 펩타이드 분석을 사용하여 공포에 질린 쥐의 뇌와 대조군의 뇌에서 측면 편도체의 다양한 세포 내 구획에서 프로테아솜 활성을 측정하는 방법을 보여줍니다. 프로테아좀은 형광 펩타이드 기질을 절단하여 형광 분자를 방출하며, 이 분자는 핵 및 시냅스 단백질 분획에서 프로테아솜 활성을 평가하기 위해 플레이트 리더를 사용하여 정량화됩니다. 핵 활동이 증가하면 유전자 발현의 변화가 일어나고, 시냅스 활동이 감소하면 장기 기억 유지에 필요한 단백질 안정화를 나타냅니다.

쥐 뇌의 다양한 세포 내 구획에서 프로테아솜 활동 측정

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

우리는 바이러스 성 퓨전 펩 티 드의 분열 사이트를 대표 하는 펩 티 드에 프로 테아의 분해 활동의 신속한 심사를 허용 하는 fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과 제시. 이 방법은 효소 활동에 대 한 테스트 하려면 단백질 시퀀스 내에서 다른 아미노산 주제에 사용할 수 있습니다.

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법...

색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

이 방법은 글루칸 포스파타제와 아밀로펙틴의 결합 친화도를 정량화하기 위한 렉틴 기반 시험관 내 침강 분석을 설명합니다. 이 공동 침강 분석은 글루칸 포스파타제 기질 결합을 측정하는 데 신뢰할 수 있으며 다양한 가용화된 글루칸 기질에 적용할 수 있습니다.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

학습하세요 카제인 기판을 이용한 비특이적 프로테아제 활성 분석 방법을 통해 티로신 방출량을 정량화하고 흡광도 측정으로 효소 활성을 산출하는 표준화된 생화학적 분석 기법을.

시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

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