시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

프로테아제는 실험실에서 펩타이드 결합을 분해합니다. 프로테아제의 활성을 측정하거나 비교하는 작업이 자주 필요하며, Sigma의 범용 프로테아제 활성 분석법은 프로테아제 활성을 결정하기 위한 표준 절차로 사용될 수 있으며, 이는 당사의 품질 관리 과정 중에 수행되는 작업입니다.

본 분석법에서 Casian은 테스트 대상인 프로테아제가 casian을 소화할 때 기질로 작용합니다. 이때 아미노산 tyrosine이 다른 아미노산 및 펩타이드 조각들과 함께 유리됩니다. 유리된 tyrosine은 fallen 및 cyl cals phenol 또는 fallen 시약과 반응하여 청색의 발색단을 생성하며, 이는 정량화가 가능하며 분광광도계를 통해 흡광도 값으로 측정됩니다.

카제인에서 더 많은 티로신이 방출될수록 더 많은 발색단이 생성되며 프로테아제의 활성이 더 강해집니다. 프로테아제 활성에 의해 생성된 흡광도 값은 알려진 양의 티로신을 FC 시약과 반응시켜 흡광도 변화를 상관관계화하여 생성한 표준 곡선과 비교합니다. 표준 곡선을 통해 마이크로몰 단위의 티로신 양을 구함으로써, 프로테아제 시료의 활성을 분당 카제인에서 방출된 티로신 당량의 마이크로몰 양인 단위(unit)로 결정할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 미주리주 세인트루이스에 있는 Sigma Aldridge DeKalb 시설의 과학자 Carrie Cup Vineyard입니다.

오늘은 Sigma Aldridge에서 프로테아제 활성을 테스트하는 보편적으로 적용 가능한 방법을 보여드리겠습니다. 저희는 주로 품질 관리 구역에서 이 분석법을 사용하여, 귀하의 실험실로 제품을 직접 배송하기 전에 프로테아제가 충분한 활성을 가지고 있는지 확인합니다. 분석을 시작하기 전에 다음 시약들이 올바르게 준비되었는지 확인해야 합니다.

pH 7.5의 50 millimolar 인산칼륨 완충액을 준비합니다. 사용 전 용액을 37 °C로 유지하며, 1L당 6.5 mg/mL를 혼합하여 제조한 0.65% w/v 카제인 용액을 첨가합니다. 용액의 온도를 부드럽게 교반하며 80~85 °C까지 서서히 높여, 균질한 분산 상태가 될 때까지 약 10분간 유지합니다.

용액을 끓이지 않는 것이 매우 중요합니다. 그 후 필요에 따라 수산화나트륨과 염산을 사용하여 pH를 조절합니다. 6.1 N 스톡 용액을 정제수로 1:55 비율로 희석하여 준비한 110 mM 트리클로로아세트산 용액과, 티로신과 반응하여 측정 가능한 색 변화를 일으키는 용액인 0.5 mM 폴 로우앤-실 칼츠(Folin-Lowy and Seal Calts) 또는 폴 로우앤-페놀(Folin-Phenol) 시약을 사용합니다.

이는 프로테아제(protease)의 활성과 직접적으로 관련이 있습니다. 정제수에 무수 탄산나트륨 53 mg/mL를 사용하여 조제한 500 mM 탄산나트륨 용액과, 37 °C에서 5 mM 칼슘이 포함된 10 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 7.5)으로 구성된 효소 희석액을 준비합니다. 이 용액들을 고체 프로테아제 시료를 용해하거나 효소 용액을 희석하는 데 사용합니다.

초기 농도가 1.1 millimolar인 L tyrosine 표준 스톡 용액(L tyrosine 0.2 milligram/mL 용액)은 정제수에 조제하며, tyrosine이 용해될 때까지 부드럽게 가열합니다. casein과 마찬가지로, 이 용액을 끓이지 마십시오. L tyrosine 표준 용액을 실온까지 식힙니다.

필요한 경우, 이 용액을 추가로 희석하여 표준 곡선을 작성합니다. 미리 활성도가 결정된 고체 프로테아제 샘플을 효소 희석액을 사용하여 0.1~0.2 units per milliliter 농도로 용해합니다. 이 용액은 품질 관리 분석을 위한 양성 대조군으로 사용되며, 효소 활성을 결정하기 위해 수행할 계산의 검증 자료로 활용됩니다. 시약을 모두 준비하고 적정 온도에 맞추었으므로, 이제 프로테아제 분석을 시작하겠습니다.

이 분석을 시작하려면 약 15 밀리리터를 담을 수 있는 적절한 바이알을 준비하십시오. 테스트할 각 효소마다 4개의 바이알이 필요합니다. 바이알 하나는 공시료(blank)로 사용하고, 나머지 세 개는 세 가지의 활성을 분석하는 데 사용합니다.

프로테아제 희석액 세 가지를 사용하여 최종 계산 결과를 서로 대조하는 것이 유용합니다. 4개의 바이알 세트 각각에 0.65% casein 용액 5 mL를 넣고 37 °C 항온수조에서 약 5분 동안 평형을 맞춥니다. 그 후, 공시료(blank)를 제외한 3개의 시험 시료 바이알에 서로 다른 농도의 효소 용액을 첨가합니다. 가볍게 흔들어 섞은 후 37 °C에서 정확히 10분 동안 배양합니다.

이 배양 시간 동안의 프로테아제 활성과 그로 인한 티로신 방출량을 측정하여 시험 샘플 간에 비교합니다. 10분간의 배양 후, 각 튜브에 TCA 시약 5 mL를 첨가합니다. 그다음, 각 튜브(공시료 포함)에 효소 용액의 최종 부피가 1 mL가 되도록 적절한 부피의 효소 용액을 첨가합니다.

이는 효소 자체의 흡광도 값을 고려하기 위함입니다. 이제 용액을 30 °C에서 30분 동안 배양하십시오. 이 30분 배양 시간 동안, 6개의 DR 바이알을 사용하여 티로신 표준 희석액을 준비하시기 바랍니다.

여기에 8mL를 충분히 담을 수 있는 6개의 바이알이 있습니다. 1.1mM tyrosine 표준 용액을 각각 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5mL의 부피로 첨가합니다. 공시료(blank)에는 tyrosine 표준 용액을 넣지 마십시오.

색 변화가 거의 없는 IPU 테스트 샘플의 경우에는 더 낮은 농도의 표준 용액이 필요할 수 있습니다. 티로신 표준 용액을 첨가한 후, 각 표준 용액에 정제수를 적절한 양으로 첨가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 배양 후, 각 테스트 용액과 공시료(blank)를 여과합니다.

0.45 micron 시린지 필터를 사용하여, 테스트 시료와 공시료 여과액 2 mL를 최소 8 mL까지 담을 수 있는 DR 바이알 4개에 각각 넣습니다. 표준물질을 조제할 때 사용한 것과 동일한 유형의 바이알을 사용할 수 있습니다. 모든 표준물질 및 표준 공시료 바이알에 탄산나트륨 5 mL를 첨가하고, 최적의 결과를 위해 즉시 팔론 시약을 첨가합니다. 그 다음, 테스트 시료와 테스트 공시료에 탄산나트륨을 첨가합니다. 탄산나트륨을 첨가하면 이 용액들이 뿌옇게 흐려지는 것을 확인할 수 있습니다.

그 다음, 유리 티로신과 반응하는 fallen 시약을 첨가합니다. 이후 DRAM 바이알을 회전시켜 혼합하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 티로신 첨가량에 따라 표준 시료들의 색상이 단계적으로 변화하며, 티로신 농도가 가장 높을수록 색이 가장 진하게 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.

테스트 샘플에서 뚜렷한 색상 변화를 확인할 수 있습니다. 이 용액 2 mL를 0.45 micron 시린지 필터와 적절한 큐벳을 사용하여 여과합니다. 이제 분석이 완료되었으므로, 분광광도계로 이동하여 흡광도 값을 기록하겠습니다.

분광광도계를 사용하여 660 nanometers의 파장에서 샘플의 흡광도를 측정합니다. 광로 길이를 1 cm로 설정하고, 표준 물질, 표준 블랭크, 다양한 테스트 샘플 및 테스트 블랭크의 흡광도 값을 기록합니다. 모든 데이터 수집이 완료되면 표준 곡선을 작성할 준비가 된 것입니다.

곡선을 생성하기 위해 표준물질과 표준 블랭크 간의 흡광도 차이를 계산해야 합니다. 이는 표준 용액 내 tyrosine 양에 기인한 흡광도 값입니다. 간단한 계산 후, Y축에는 표준물질의 흡광도 변화를, X축에는 다섯 가지 표준물질 각각의 마이크로몰(µmol) 양을 플롯하여 표준 곡선을 작성합니다.

데이터 지점을 모두 입력한 후 최적 적합선을 생성합니다. 그다음 테스트 샘플의 흡광도와 테스트 공시료의 흡광도 차이를 계산하여 테스트 샘플의 흡광도 변화량을 구합니다. 표준 곡선을 참조하여 Y축에서 테스트 샘플 중 하나의 흡광도 값을 확인합니다. 이제 X축과 평행하게 선을 그려 표준 곡선과 만나는 지점에서 멈춥니다.

그런 다음 이 지점에서 얻은 X 좌표를 통해, 해당 단백질 분해 반응 동안 방출된 티로신의 양과 마이크로몰(µmol) 수를 알 수 있습니다. 밀리리터당 유닛(units per milliliter)으로 효소 활성도를 구하려면 다음과 같이 계산하십시오. 표준 곡선에서 얻은 방출 티로신 당량의 마이크로몰 수에 분석법의 총 부피인 11 mL를 곱합니다. 그런 다음 이 값을 다른 세 가지 수치로 나눕니다.

분석 시간은 10분 동안 진행하였으며, 분석에 사용된 효소의 부피는 다양하게 조절하였습니다. 여기서는 1 mL를 사용하겠습니다. 비색 검출에 사용되는 mL 부피는 사용하시는 Qvet에 따라 다를 수 있습니다.

2 mL를 사용합니다. 티로신(tyrosine)의 마이크로몰(µmol) 수를 분 단위 시간으로 나누면, '단위(unit)'라고 부르는 프로테아제 활성 측정값이 산출됩니다. 분자와 분모에서 부피 측정 단위를 상쇄하면, 결과적으로 mL당 단위(unit/mL)로 표시되는 효소 활성 측정값이 남게 됩니다.

효소 희석액에 희석된 고체 프로테아제 샘플의 활성을 결정하기 위해, 밀리리터당 단위(units per milliliter)로 계산된 활성을 본 분석에 처음 사용된 고체의 농도(mg/mL)로 나눕니다. 이렇게 하면 밀리그램당 단위(units per milligram)로 된 활성 값이 산출됩니다. 지금까지 Sigma의 범용 프로테아제 활성 분석법을 사용하여 프로테아제 활성을 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 본 절차를 수행할 때 확인하셨듯이, 카제인과 티로신 용액 모두를 천천히 가열하고 끓지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.

또한, 표준물질과 각각의 테스트 샘플 모두에 대해 서로 다른 블랭크를 준비하는 것이 매우 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 프로테아제 활성 측정 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.