Name: Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-02T13:52:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: 배우세요 Xenopus 에그 추출물을 이용한 체외 핵 어셈블리 방법을. 정자 염색질과 세포질 성분을 결합하여 기능적 핵을 형성하고 형광 염색으로 관찰하는 세포생물학 연구 기법입니다.

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이 실험 방법에 대한 전체 텍스트 프로토콜에서 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">셀룰러 생물학의 현재 프로토콜</a> .

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

fractionated xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

핵 막 어셈블리는 세포 분열주기에서 중요한 단계이며이 과정은 Xenopus의 정자 염색질, cytosol, 가벼운 멤브레인 분수를 결합하여 시험관에서 복제하실 수 있습니다. 완료 핵은 기공 단지와 함께 핵 세포막을 포함하여 형성하고, 이러한 재구성 핵 정상 핵 프로세스의 수입니다.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

핵막 조립은 세포 분열 주기의 필수적인 단계이며, Xenopus 정자와 ...를 결합함으로써 시험관 내에서 이 과정을 재현할 수 있습니다.

Xenopus laevis 난자 추출물은 핵 조립 및 핵 단백질 수송과 같은 세포 내 사건의 인 비트로(in vitro) 재구성을 위한 세포질 및 세포소기관 물질로서 유용합니다. 정자 염색질 DNA를 조추출물 또는 분획된 XUS 난자 추출물에 첨가하면, 추출물 내의 막 소포가 염색질 표면에 결합하여 융합되고, 핵공 복합체 성분들을 통합하여 완전히 기능하는 합성 핵을 형성합니다. 이후 추출물의 면역 고갈법 및 단백질 편집을 통해 이러한 과정의 분자적 기초를 특성화할 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Marie Cross이며 조지아주 애틀랜타에 위치한 Emory University 세포생물학과의 Dr. Maureen Power 연구실에서 공부하고 있는 대학원생입니다. 오늘은 분획된 제브라피쉬 난자 추출물을 사용하여 시험관 내(in vitro)에서 핵을 형성하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 절차는 핵 조립 반응 수행 및 핵 형성 평가의 단계로 구성됩니다.이제 시작해 보겠습니다. 핵 조립을 시작하기 위해, 분획된 세포질의 일부를 취해 0.2 M 스톡의 phosphocreatine을 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가합니다. 그런 다음 5 mg/mL 스톡의 creatine kinase를 최종 농도 50 µg/mL가 되도록 첨가하십시오.마지막으로, 0.2 M 스탁 용액을 사용하여 20 µM A TP를 첨가합니다. 그다음, cytosol에 light membrane을 1:10 비율로 희석하여 첨가합니다. 이는 원래의 조추출물(crude extract)에 존재하는 막의 양과 유사하게 맞춘 것입니다.피펫팅을 통해 모든 성분을 위아래로 섞어 추출물 내에 막 성분들을 분산시킵니다. 이 작업은 정자 염색질을 첨가하기 전에 완료해야 합니다. 다음으로, 원하는 농도로 분획된 추출물에 정자 염색질을 첨가하고, 컷오프 팁을 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫팅함으로써 추출물과 정자를 즉시 함께 섞어줍니다.정자 염색질을 추출물에 첨가하면, 즉시 응축 해제와 응축이 시작되며 전단력에 취약해집니다. 일반적으로 이러한 반응은 총 부피가 100 microliters 미만인 500 microliter 원심분리 튜브에서 진행됩니다. 난자 추출물은 최대 8,000에서 9,000개까지의 형성을 지원합니다.마이크로리터당 핵 수를 조절하여, 핵이 형성될 수 있도록 혼합물을 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다. 핵은 염색을 통해 시각화합니다. 약 30분 후, 새로 형성된 핵은 크기가 작고 타원형 모양을 띠게 됩니다.DNA는 여전히 상당히 응축되어 있으며, UV 채널로 관찰하면 DNA가 응축됨에 따라 핵은 후크 회전(hook spinning)으로 인해 연한 파란색의 고체 형태로 보일 것입니다. 또한, 파란색 염색은 덜 균질해지며 결국 검은색 간극이 나타나게 됩니다. 고정액에 수컷당 1 µg의 3,3'-diaminobenzidine 또는 DHCC를 첨가함으로써 핵막 형성을 시각화할 수 있습니다.DHCC는 플루오레세인 채널에서 시각화되는 형광성 지질친화성 염료입니다. 핵 조립의 초기 단계에서 막 소포가 염색질 표면에 결합하고 부분적으로 융합되기 시작합니다. 이로 인해 형성 중인 막이 불균일하고 불연속적인 모습으로 나타나게 됩니다.막이 완성되면 핵 표면에서 매끄럽게 펴지며, DNA 주변으로 끊어짐 없이 균일한 테두리 형태로 나타납니다. 핵으로 통합되지 않은 막 소포체들로 인해 주변 세포질에 상당한 수준의 배경 형광이 관찰될 것입니다. 지금까지 xenopus 난자 추출물의 가용성 분획과 경량 막 분획을 이용한 인비트로(in vitro) 핵 재구성을 살펴보았습니다.조추출물은 핵 조립(nuclear assembly)에 사용할 수 있지만, 냉동 및 해동 후에는 사용할 수 없다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

in-vitro-nuclear-assembly-using-fractionated-xenopus-egg-extracts

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

원유 및 fractionated Xenopus 달걀 추출물은 형태학의 및 생화 학적 분석을위한 세포 프로세스를 reconstituting을위한 재료를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 계란 용해 및 차등 원심 분리가에 차례로 fractionated 추출물과 가벼운 막 준비를 준비하는 데 사용되는 원유 추출을 준비하는 데 사용됩니다.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

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트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

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생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

방법은 Xenopus의 계란 추출물 및 단백질 분해의 저분자 변조기에 대한 고 처리량 스크리닝을 위해 그 적응 방사성 표지와 루시퍼 라제 융합 단백질을 이용하여 단백질 분해 분석에 대해 설명한다.

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Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

세포 및 세포 내 스케일링의 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. Xenopus 배아 추출물의 사용은 세포 기관 크기 조절의 메커니즘을 밝히기 위해 점점 더 보편화되고 있습니다. 이 방법은 배아 추출물 준비와 핵 크기 조절 메커니즘을 확인할 수 있는 새로운 핵 스케일링 분석을 설명합니다.

사용하여 셀 - 무료 분석<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em&gt; 배아 핵 크기 규제의 메커니즘을 연구하기 위해 추출

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.

제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법

배우세요 Xenopus 에그 추출물을 이용한 체외 핵 어셈블리 방법을. 정자 염색질과 세포질 성분을 결합하여 기능적 핵을 형성하고 형광 염색으로 관찰하는 세포생물학 연구 기법입니다.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

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