Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Xenopus laevis 난자 추출물은 핵 조립 및 핵 단백질 수송과 같은 세포 내 사건의 인 비트로(in vitro) 재구성을 위한 세포질 및 세포소기관 물질로서 유용합니다. 정자 염색질 DNA를 조추출물 또는 분획된 XUS 난자 추출물에 첨가하면, 추출물 내의 막 소포가 염색질 표면에 결합하여 융합되고, 핵공 복합체 성분들을 통합하여 완전히 기능하는 합성 핵을 형성합니다. 이후 추출물의 면역 고갈법 및 단백질 편집을 통해 이러한 과정의 분자적 기초를 특성화할 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Marie Cross이며 조지아주 애틀랜타에 위치한 Emory University 세포생물학과의 Dr. Maureen Power 연구실에서 공부하고 있는 대학원생입니다. 오늘은 분획된 제브라피쉬 난자 추출물을 사용하여 시험관 내(in vitro)에서 핵을 형성하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 절차는 핵 조립 반응 수행 및 핵 형성 평가의 단계로 구성됩니다.

이제 시작해 보겠습니다. 핵 조립을 시작하기 위해, 분획된 세포질의 일부를 취해 0.2 M 스톡의 phosphocreatine을 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가합니다. 그런 다음 5 mg/mL 스톡의 creatine kinase를 최종 농도 50 µg/mL가 되도록 첨가하십시오.

마지막으로, 0.2 M 스탁 용액을 사용하여 20 µM A TP를 첨가합니다. 그다음, cytosol에 light membrane을 1:10 비율로 희석하여 첨가합니다. 이는 원래의 조추출물(crude extract)에 존재하는 막의 양과 유사하게 맞춘 것입니다.

피펫팅을 통해 모든 성분을 위아래로 섞어 추출물 내에 막 성분들을 분산시킵니다. 이 작업은 정자 염색질을 첨가하기 전에 완료해야 합니다. 다음으로, 원하는 농도로 분획된 추출물에 정자 염색질을 첨가하고, 컷오프 팁을 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫팅함으로써 추출물과 정자를 즉시 함께 섞어줍니다.

정자 염색질을 추출물에 첨가하면, 즉시 응축 해제와 응축이 시작되며 전단력에 취약해집니다. 일반적으로 이러한 반응은 총 부피가 100 microliters 미만인 500 microliter 원심분리 튜브에서 진행됩니다. 난자 추출물은 최대 8,000에서 9,000개까지의 형성을 지원합니다.

마이크로리터당 핵 수를 조절하여, 핵이 형성될 수 있도록 혼합물을 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다. 핵은 염색을 통해 시각화합니다. 약 30분 후, 새로 형성된 핵은 크기가 작고 타원형 모양을 띠게 됩니다.

DNA는 여전히 상당히 응축되어 있으며, UV 채널로 관찰하면 DNA가 응축됨에 따라 핵은 후크 회전(hook spinning)으로 인해 연한 파란색의 고체 형태로 보일 것입니다. 또한, 파란색 염색은 덜 균질해지며 결국 검은색 간극이 나타나게 됩니다. 고정액에 수컷당 1 µg의 3,3'-diaminobenzidine 또는 DHCC를 첨가함으로써 핵막 형성을 시각화할 수 있습니다.

DHCC는 플루오레세인 채널에서 시각화되는 형광성 지질친화성 염료입니다. 핵 조립의 초기 단계에서 막 소포가 염색질 표면에 결합하고 부분적으로 융합되기 시작합니다. 이로 인해 형성 중인 막이 불균일하고 불연속적인 모습으로 나타나게 됩니다.

막이 완성되면 핵 표면에서 매끄럽게 펴지며, DNA 주변으로 끊어짐 없이 균일한 테두리 형태로 나타납니다. 핵으로 통합되지 않은 막 소포체들로 인해 주변 세포질에 상당한 수준의 배경 형광이 관찰될 것입니다. 지금까지 xenopus 난자 추출물의 가용성 분획과 경량 막 분획을 이용한 인비트로(in vitro) 핵 재구성을 살펴보았습니다.

조추출물은 핵 조립(nuclear assembly)에 사용할 수 있지만, 냉동 및 해동 후에는 사용할 수 없다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.