체외에서 분리된 뉴런을 조작에 대한 레이저 족집게를 사용하여

Ashkin은 레이저 트위저 또는 광학 트랩이 미세한 크기의 살아있는 생물체를 조작하는 강력한 도구임을 처음으로 입증했습니다. 본 영상에서는 이 기술을 적용하여 뉴런을 포착하고 이동시키는 방법을 보여드리겠습니다. 이것이 광학 트위저 워크스테이션입니다.

초록색 화살표는 현미경 광학계를 통과하는 레이저 빔의 경로를 나타냅니다. 현미경 대물렌즈에 의해 집광된 레이저 빔이 세포에 의해 굴절될 때, 광선의 방향을 바꾸는 힘이 세포에 작용하여 세포를 초점 중심으로 이동시킵니다.

이는 세포를 배지 너머로 끌어당기기에 충분한 pN(피코뉴턴)의 힘을 생성합니다. 본 영상에서는 디쉬 제작, 망막 세포 준비, 배양 디쉬에 세포 도말, 레이저 집게 조작 및 세포 성장 관찰에 대해 다룹니다. 세포는 유리에 부착되므로, 집게로 세포를 쉽게 포획할 수 있도록 세포 부착 방지 영역을 만들어야 했습니다.

디쉬의 절반은 세포 반발성 폴리머인 poly hema로 코팅되었습니다. 나머지 절반은 세포 성장을 지원하는 기질인 cell one으로 코팅되었습니다. 먼저, 디쉬의 세포 접착성 측면에서 세포를 식별합니다.

그 후 다른 세포를 폴리머 쪽에 포획하여 접착제 쪽으로 운반함으로써 두 세포를 쌍으로 결합시킵니다. 배양 접시를 준비하기 위해, 먼지를 제거하고 멸균 처리된 35 millimeter Polystar 배양 접시를 사용합니다. 먼저, 소형 선반이나 드릴 프레스를 사용하여 바닥에 1 centimeter 크기의 구멍을 뚫습니다.

산 세척된 커버 글라스를 준비하여 후드와 같이 먼지가 없는 환경에 똑바로 세워 둡니다. 95% alcohol에 용해된 polyus 용액을 취하여 커버 글라스 상단의 절반 부분에만 몇 방울 떨어뜨립니다. poly hema가 마를 때까지 기다립니다. 커버 글라스의 polyus 처리 면을 표시합니다.

배양 접시 바닥의 구멍 주위에 S 가드를 배치합니다. S 가드를 사용하여 커버 글라스를 접시에 접착합니다. 폴리아미드가 안쪽에 위치하도록 하고, 실 가드의 틈새로 누수가 없는지 확인하십시오.

커버 글라스를 poly hema 코팅의 가장자리가 디쉬의 중앙을 지나도록 배치합니다. 디쉬를 2~3일 동안 건조시킨 후, 다이아몬드 팁 펜으로 디쉬 바닥에 표시를 긁어 만듭니다. 이 표시는 현미경 스테이지 위에 디쉬를 배치할 때 기준점으로 사용됩니다. 디쉬를 후드 안에 넣고 자외선 램프로 멸균합니다.

염소 항-US 항체 용액 한두 방울을 디쉬의 비 폴리우스(non polyus) 쪽에 떨어뜨리되, 폴리 헤믹 코팅(poly hemic coating) 위에 쏟아지지 않도록 주의하며 약 3시간 동안 그대로 둡니다. 용액을 제거하고 멸균 링거액(sterile ringers)으로 세척합니다. 동일한 부위에 세포 1 항체 용액을 도포하고 하룻밤 동안 배양하여 다음 날 실험 준비를 마칩니다.

본 연구실의 세포는 성체 수생 단계 도롱뇽의 망막에서 유래되었습니다. 망막을 박리하여 제거한 후, 효소로 소화시킵니다. 그 후 배양 접시에 분리된 세포를 도말할 수 있습니다.

안구를 제거합니다. 각막을 절개하여 제거합니다. 안구 컵을 멸균 링거액에 넣습니다.

곡선 핀셋의 가장자리로 긁어내어 망막을 안구 컵에서 분리합니다. 프로판이 포함된 링거 용액에 이산화탄소와 산소를 버블링한 다음, 0.2 µm 초미세 필터로 멸균합니다. 망막을 효소 용액에 넣고 조직을 분해하기 위해 흔들어주며 약 40분 동안 소화시킵니다.

세 번 세척한 후, tri를 사용하여 망막을 해리합니다. 3mm 볼 피펫을 사용하여 분리된 세포를 플레이팅할 수 있도록 준비합니다. 배지가 들어 있는 배양 접시를 현미경 스테이지 위에 놓고 접시 바닥의 스크래치 표시를 이용해 적절하게 방향을 맞춥니다.

이를 통해 향후 동일한 시점에 디쉬의 정확한 위치를 재현할 수 있습니다. 그런 다음, 디쉬의 poly hema 처리면과 cell one 처리면 양쪽 모두에 세포를 플레이팅합니다. 마이크로스코프 스테이지 위의 디쉬 위치와 레이저 출력은 조이스틱으로 조절합니다.

먼저, 디쉬 한쪽 면에 부착된 세포를 확인했습니다. 이는 수상돌기로 식별 가능한 망막 다극세포입니다. 세포 위치의 좌표를 저장합니다.

이것은 디쉬의 polyus 세포 반발성 쪽에 위치한 간상 광수용기 세포입니다. 디쉬를 낮추면 레이저가 세포를 포착하여 디쉬 바닥에서 띄워 올립니다. 이제 세포는 디쉬의 반대편에 있는 다극성 세포의 좌표로 이동됩니다.

실제로 세포는 정지해 있습니다. 움직이는 것은 배양 접시입니다. 이제 세포가 poly hemo 코팅의 가장자리를 지나가고 있습니다.

세포에서 뻗어 나온 돌출부는 축삭 말단입니다. 세포는 접시 바닥의 잔해 및 다른 세포들과 충분히 떨어져 있으며, 이러한 요소들은 세포의 이동을 방해할 수 있습니다. 접시 바닥에 있는 세포들의 디포커스(defocus) 이미지가 배경에 보입니다.

간상세포가 다극세포에 도달하며, 해당 세포로부터 원하는 지점과 거리로 정확하게 위치시킬 수 있습니다. 배양 접시를 들어 올리면 세포가 세포 1 기질에 부착됩니다. 이 절차의 주요 장점은 이동시킬 세포를 선택할 수 있다는 점과 밀폐된 멸균 실험 환경에서 조작이 가능하다는 점입니다.

세포 간 상호작용은 비디오 타임랩스 또는 디지털 사진 촬영으로 모니터링할 수 있습니다. 레이저 트위저(Laser tweezers)는 모든 생물학적 기법과 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서는 형광 기법을 통해 트위저로 이동시킨 세포 간의 연결 지점에 시냅스 단백질이 존재함을 보여줍니다.