Name: 루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 배우세요 루시페라제 기반 리포터 유전자 분석을 이용하여 막 생합성 유전자 발현을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 세포 생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

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세포 배양 <ol><li> 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 재고 문화가 항생제의 칵테일 (페니실린의 ML 당 100 단위 및 100 μg와 보충 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)으로 구성된 &#39;매체&#39;에 10 cm 문화 요리에 재배 당 스트렙토 마이신 황산의 ML)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS). </li><li> 실험 세포를 설정하려면, 매체가 해제 빨려이며, 세포는 인산 5 ML로 두 번 씻어하는 것은 생리 (PBS) 솔루션을 버퍼. </li><li> PBS 그런 다음 제거하고 0.25 %의 트립신을 포함하는 솔루션 0.6 ML로 대체됩니다. </li><li> 세포 분리하기 시작했다 때까지 요리는 37 ˚ C 약 2 분 incubated입니다. </li><li> 매체의 5.5 ML은이 트립신을 중화에 추가되고 세포는 hemocytometer로 계산됩니다. </li><li> 전지는 ML 당 320,000 세포에 희석하고 polylysine - 코팅 96 - 웰 플레이트 문화에 잘 당 0.1 ML에 적절하고 있습니다. </li><li> 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장. </li></ol> Transfections <ol><li> transfections 준비에서, 그것은 실험 조건에 따라 수행과 플라스미드의 양의 어떤 transfected 될 수 얼마나 많은 복제로 간주되어야합니다. 우리는 일상적으로 세중의 모든 조건을 수행하고 잘 따라 플라스미드 DNA의 50-100 NG 총 transfect. 플라스미드 믹스 적어도 기자 반딧불 루시페라제 및 제정 모터의 제어 플라스미드 표현 Renilla의 루시페라제 표현을 구성 포함해야합니다. </li><li> 플라스미드 솔루션은 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 pipetted 및 혈청 - 무료 항생제없는 DMEM의 샘플 당 10 μl로 보충하고 있습니다. 20 우물 각 50 μg의 DNA와 transfected 수있다면 예를 들어, 1 μg의 DNA 200 μl DMEM를 추가합니다. </li><li> DMEM / DNA 솔루션 μg의 DNA 당 3 μl &#39;트랜짓 293 시약&#39;(Mirus)을 추가할 수 있습니다. &amp;을 아래로 pipetting으로 혼합하고 최소 10 분 상온에서 샘플 서 보자. </li><li> 이 기간 동안, 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 신선한 중간 A. 90 μl로 교체 </li><li> 각 잘 DMEM / DNA / 운송 293 혼합 10 μl를 추가합니다. </li><li> 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장. </li></ol> Phagocytosis <ol><li> 미디어 B를 플러스 (DMEM과 F12 햄의 중간 플러스 항생제와 10 % FBS의 1:1 혼합물) ML 당 제로 1 MG에서 0.75 - μm의 라텍스 구슬이 들어 suspensions를 준비합니다. </li><li> 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 중간 B.의 비드 suspensions의 0.1 ML로 교체 </li><li> 1000 X G. 2 분 플레이트 스핀 </li><li> 세포는 다음 37 ˚ C 6-16 시간에 대한 양식입니다. 조건 및 루시페라제 증가 리포터 유전자 발현이 1로 3 시간 후에 감지 수 있습니다 운전하는 데 사용되는 모터에 따라 다릅니다. </li><li> 같은 경우에는 그것이 30-60 분 구슬로 세포를 부화 필요할 수 있습니다 다음, 비법인 구슬을 제거하고, 시간의 추가 기간을 위해 세포를 잠복기 전에 새로운 미디어를 추가하는 PBS 2 세척 할. </li></ol> 듀얼 GloTM 루시페라제 어세이 <ol><li> 참고 :이 키트를 사용을위한 프로토콜은 제조 업체에서 권장하는 것과 몇 가지 측면에서 다릅니다. 이것은 샘플 당 필요한 시약의 양을 줄이기 위해 수정되었습니다. </li><li> -20 ˚ C. 여러 작은 aliquots 및 저장에 1 M DTT, 분할의 솔루션을 준비 </li><li> 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.8), 10 % (V / V) 글리세롤, 그리고 0.5 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 용해 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에, 나누어지는 실험에 필요한 금액과 1X로 0.5의 최종 농도 1 M DTT 플러스 테아제 억제제 칵테일의 ML 당 1 μl를 추가합니다. 남은 DTT 솔루션을 재사용하지 마십시오. </li><li> 처음으로 듀얼 GloTM 키트를 사용할 경우, 듀얼 GloTM 루시페라제 기판 한 병 (제공하는 듀얼 GloTM 루시페라제 버퍼 한 병 (키트와 함께 제공)의 전체 내용을 전송하여 (반딧불) 루시페라제 시약 준비 키트와 함께). -20 ˚ C. 10 - ML aliquots 및 저장에 사용하지 않는 루시페라제 시약 디비드 </li><li> 조직 문화의 인큐베이터에서 96 - 웰 플레이트를 제거하고 얼음에 놓으십시오. 흡인하여 미디어를 제거, 40 μl 당 우물의 용해 버퍼를 추가한 다음 30 분 얼음 접시를 두십시오. </li><li> 잘 루시페라제 시약의 다음 당 흰색, 불투명한에서 96 - 웰 플레이트 (OptiplateTM - 96, 퍼어킨 엘머 카탈로그 번호 6005290) 나누어지는 15 μl은 세포 lysate 15 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 실온에서 접시를 부화 후 microplate 리더의 발광을 읽어보십시오. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 1 일부 듀얼 GloTM 스톱 &amp; 글로을 추가하여 Renilla 루시페라제 기판 솔루션의 적절한 금액을 준비 ®; 시약 (키트와 함께 제공) 100 부품 듀얼 GloTM 스톱 &amp; 글로 ® 버퍼 (키트와 함께 제공)합니다. </li><li> 각 물론 10 분에 대해 실온에서 품어 Renilla 루시페라제 기판 솔루션을 15 μl 당 우물을 추가 후 다시 발광을 측정합니다. </li></ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 biogenesis 유학

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

멤브레인 biogenesis 동안 다른 지질 합성 경로의 조정을 연구하기 위해 그것은 멤브레인 biogenesis 빠르게하고 inducible 방식에서 발생하는 실험 시스템을 작동하는 데 유용합니다. 우리는 세포가 빠르게 입자 engulfment 동안 자료를 배치로 손실 막 풀을 보충 막 lipids를 종합으로 라텍스 구슬의 phagocytosis가 이러한 목적을 위해 실용적인 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 Promega에서 듀얼 글로 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

막 생합성 과정 중 서로 다른 지질 합성 경로의 협응을 연구하기 위해서는, 막... 이 조절되는 실험 체계를 활용하는 것이 유용합니다.

안녕하세요, 저는 기억과 생합성을 위한 다양한 지질 합성 경로의 조율을 연구하는 IL OV입니다. 막 생합성이 빠르게 일어나고 유도되는 실험 시스템을 갖추는 것은 매우 유용합니다. 저희는 라텍스 비드의 식세포 작용이 이러한 연구에 특히 유용하다는 것을 발견했는데, 이는 세포가 포식 과정 초기에 래핑 물질로 소실된 막을 보충하기 위해 새로운 막을 매우 빠르게 합성하기 때문입니다.이 영상에서 제 동료인 Ong Zang이 Luciferase 기반 리포터 분석법을 사용하여 식세포 작용으로 유도된 유전자 발현 변화를 연구하는 절차를 시연하겠습니다. 안녕하세요, 저는 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과의 X입니다. 오늘은 리포터 유전자 분석법을 사용하여 식세포 작용 후 막 생합성에 관여하는 유전자의 조절을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.본 실험 과정에서는 인간 배아 신장 293 세포 배양물을 사용합니다. 이 세포들은 Basal Modified Eagle's Medium(DMEM)에 10% fetal bovine serum(FBS)과 항생제 칵테일을 첨가한 배지 A가 담긴 10 cm 배양 접시에서 배양됩니다. 표준화 기술을 사용하여 접시 바닥에서 세포를 떼어내어 수를 센 후, 폴리라이신이 코팅된 96-well 플레이트에 분주하여 transfection 시작 전까지 24시간 동안 배양합니다.형질전환의 경우, 모든 조건을 통상적으로 3회 반복 수행하며, 웰당 총 50~100 ng의 플라스미드 DNA를 형질전환합니다. 플라스미드 혼합물에는 firefly luciferase를 발현하는 리포터 컨스트럭트와 구성적 프로모터(constitutive promoter)로부터 renal luciferase를 발현하는 컨트롤 플라스미드가 최소한으로 포함되어야 합니다. 우선, serum-free 및 antibiotic-free DMEM에 trans293 형질전환 시약을 혼합하여 준비합니다. 형질전환할 각 웰마다 10 µL의 DMEM을 사용하고, 플라스미드 DNA 1 µg당 3 µL의 trans293 시약을 첨가합니다.예를 들어, 200 µL의 DMEM에 3 µL의 trans 2 9 3 시약과 50 ng의 DNA를 사용하여 트랜스펙션을 수행할 웰 20개를 준비하는 경우입니다. 용액을 피펫팅으로 반복해서 섞은 후, 실온에서 최소 5분 동안 그대로 둡니다. 그다음, DNA를 각각의 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 보통 플라스미드 스톡 용액의 농도는 10~100 ng/µL 사이입니다.DM M 전이 혼합물을 5분 동안 배양한 후, 이를 DNA 튜브로 옮기고 피펫팅하여 용액을 다시 혼합합니다. 그다음 시료를 상온에서 20분 동안 방치합니다. 20분간의 배양 동안 96웰 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 19 µL의 신선한 배지 A로 교체하며, 배양이 완료되면 각 웰에 10 µL의 D-M-M-D-N-A 전이 혼합물을 분주합니다.혼합액을 기존 액체 속으로 직접 피펫팅해야 합니다. 피펫 팁이 튜브 벽에 닿지 않도록 주의하십시오. 또한, 검사하지 않고 그대로 둘 세포 웰 3개를 포함하는 것이 중요합니다.이 웰들의 평균 루시페라아제 활성은 나중에 배경값으로 차감됩니다. 96웰 플레이트를 37 °C 배양기에 넣고 세포를 24시간 동안 배양합니다. 24시간 배양이 완료되면 막 생합성 및 lax bead의 생합성을 유도하는 과정을 진행합니다. 먼저, 세포 배양 배지와 lax bead를 포함하는 현탁액을 준비합니다.이를 위해 DMEM과 HEMPS, F-term medium 및 항생제와 10% FBS를 1:1 비율로 혼합한 medium B를 준비합니다. 그 다음 0.75 micron lax beads를 최대 1 mg/mL 농도로 첨가합니다. 당연히 모든 실험에는 beads를 첨가하지 않은 대조군이 포함되어야 합니다.다음으로, 96-well 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 각 웰에 100 µL의 비드 현탁액을 채웁니다. 현탁액을 첨가한 후, 플레이트를 1000 G에서 2분 동안 원심 분리합니다. 이는 비드를 웰 바닥에 농축시켜 식세포 작용을 촉진하는 데 도움이 됩니다. 이어서, 37 °C에서 6~16시간 동안 세포를 배양하여 캡처합니다.조건과 루시페라아제 증가를 유도하는 데 사용되는 프로모터에 따라, 프로모터 유전자 발현은 1~3시간 후에 검출될 수 있습니다. 특정 실험에서는 예를 들어 입자의 거동에 영향을 주지 않고 특정 약물이 지질 합성에 미치는 영향을 연구하기 위해 fal을 지질 합성으로부터 분리해야 할 수도 있습니다. 이러한 경우, 세포가 비즈를 세포 내로 섭취할 수 있도록 비즈와 함께 30~60분 동안 배양하십시오.이 배양 단계 후에, 결합되지 않은 비드를 제거하기 위해 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 신선한 배지를 첨가하고 리포터 유전자 발현을 위해 세포를 6~16시간 동안 배양합니다. 이제 형광 분석을 진행할 준비가 되었습니다.Lucifer 분석을 시작하기 위해, 사용 전 20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10% (v/v) glycerol 및 0.5% (v/v) Triton X-100을 포함하는 xis 버퍼를 실험에 필요한 충분한 양으로 준비하십시오. 그 다음, 1 M DTT를 1 µL/mL 비율로 첨가하십시오. 남은 DTT 용액은 재사용하지 마십시오.그다음 프로테아제 억제제 칵테일을 최종 농도 0.5에서 1배가 되도록 첨가합니다. Dual-Glo 키트를 처음 사용할 때는 Dual-Glo luciferase buffer 한 병의 전체 내용을 Dual-Glo luciferase substrate 한 병으로 옮겨 firefly luciferase 시약을 준비하십시오. 사용하지 않은 luciferase 시약은 10 mL 튜브에 나누어 담아 -20 °C에서 보관합니다. luciferase 시약이 준비되면 96-well 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 꺼내 얼음 위에 올립니다. 이어서 흡입법으로 배지를 제거한 후, well당 40 µL의 lysis buffer를 첨가하고 플레이트를 얼음 위에 30분 동안 둡니다.다음으로, 웰당 15 µL의 Lucifer 시약을 분주합니다. 흰색 불투명 96-웰 플레이트로 Perkin S optive plate 96를 사용합니다. 그런 다음 15 µL의 세포 용해물을 첨가하고 플레이트를 상온에서 10분 동안 배양합니다.10분 후, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 발광도를 측정합니다. 다음으로, 대조군 플라스미드 데이터를 얻기 위해 바닐라 루시퍼레이즈 분석을 수행합니다. 이를 위해 dual glow, stop and glow 시약을 100분량의 용액에 1분량씩 추가하여 적절한 양의 루시퍼레이즈 기질 용액을 직전에 준비합니다.Dual-glow, stop and glow 버퍼입니다. 다음으로, 각 웰에 기질 용액 15 µL를 첨가합니다. 플레이트를 상온에서 10분 동안 배양한 후, 발광도를 다시 측정합니다.이 dual glow ferous assay의 경우, 제조사에서 권장하는 프로토콜을 수정하여 적용했음을 유의하시기 바랍니다. 프로 샘플에 필요한 시약의 양을 줄이기 위해, 이제 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 다시 분석할 수 있습니다. 마이크로 플레이트 리더로 데이터를 수집한 후에는, 추가 분석을 위해 Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램으로 데이터를 전송할 수 있습니다.먼저, 절제되지 않은 3개 well의 평균값을 계산하고, 각 데이터 포인트에서 해당 값을 뺍니다. 다음으로, transfection이 수행된 각 well에 대해 firefly luciferase 값을 나눕니다. luciferase에 대해 이를 수행한 후, 각 3반복 샘플 세트에 대해 평균, 표준편차 및 변동계수를 계산합니다.본 예시에서는 x축에 표시된 다양한 농도의 비드와 파이어플라이 루시퍼레이스 대비 바닐라 루시퍼레이스 활성 비의 관계를 이용하였습니다. 보시는 바와 같이, 이 비는 농도 의존적으로 증가합니다. 지금까지 라텍스 비드의 식세포 작용에 반응하여 LDL 수용체 프로모터로부터의 발현을 측정하기 위해 루시퍼레이스 기반 리포터 유전자 분석법을 사용하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, transfection 시점에 세포의 합류도(confluency)가 80~90%가 되도록 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

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배우세요 루시페라제 기반 리포터 유전자 분석을 이용하여 막 생합성 유전자 발현을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 세포 생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

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