Name: 루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 배우세요 루시페라제 기반 리포터 유전자 분석을 이용하여 막 생합성 유전자 발현을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 세포 생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

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세포 배양 <ol><li> 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 재고 문화가 항생제의 칵테일 (페니실린의 ML 당 100 단위 및 100 μg와 보충 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)으로 구성된 &#39;매체&#39;에 10 cm 문화 요리에 재배 당 스트렙토 마이신 황산의 ML)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS). </li><li> 실험 세포를 설정하려면, 매체가 해제 빨려이며, 세포는 인산 5 ML로 두 번 씻어하는 것은 생리 (PBS) 솔루션을 버퍼. </li><li> PBS 그런 다음 제거하고 0.25 %의 트립신을 포함하는 솔루션 0.6 ML로 대체됩니다. </li><li> 세포 분리하기 시작했다 때까지 요리는 37 ˚ C 약 2 분 incubated입니다. </li><li> 매체의 5.5 ML은이 트립신을 중화에 추가되고 세포는 hemocytometer로 계산됩니다. </li><li> 전지는 ML 당 320,000 세포에 희석하고 polylysine - 코팅 96 - 웰 플레이트 문화에 잘 당 0.1 ML에 적절하고 있습니다. </li><li> 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장. </li></ol> Transfections <ol><li> transfections 준비에서, 그것은 실험 조건에 따라 수행과 플라스미드의 양의 어떤 transfected 될 수 얼마나 많은 복제로 간주되어야합니다. 우리는 일상적으로 세중의 모든 조건을 수행하고 잘 따라 플라스미드 DNA의 50-100 NG 총 transfect. 플라스미드 믹스 적어도 기자 반딧불 루시페라제 및 제정 모터의 제어 플라스미드 표현 Renilla의 루시페라제 표현을 구성 포함해야합니다. </li><li> 플라스미드 솔루션은 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 pipetted 및 혈청 - 무료 항생제없는 DMEM의 샘플 당 10 μl로 보충하고 있습니다. 20 우물 각 50 μg의 DNA와 transfected 수있다면 예를 들어, 1 μg의 DNA 200 μl DMEM를 추가합니다. </li><li> DMEM / DNA 솔루션 μg의 DNA 당 3 μl &#39;트랜짓 293 시약&#39;(Mirus)을 추가할 수 있습니다. &amp;을 아래로 pipetting으로 혼합하고 최소 10 분 상온에서 샘플 서 보자. </li><li> 이 기간 동안, 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 신선한 중간 A. 90 μl로 교체 </li><li> 각 잘 DMEM / DNA / 운송 293 혼합 10 μl를 추가합니다. </li><li> 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장. </li></ol> Phagocytosis <ol><li> 미디어 B를 플러스 (DMEM과 F12 햄의 중간 플러스 항생제와 10 % FBS의 1:1 혼합물) ML 당 제로 1 MG에서 0.75 - μm의 라텍스 구슬이 들어 suspensions를 준비합니다. </li><li> 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 중간 B.의 비드 suspensions의 0.1 ML로 교체 </li><li> 1000 X G. 2 분 플레이트 스핀 </li><li> 세포는 다음 37 ˚ C 6-16 시간에 대한 양식입니다. 조건 및 루시페라제 증가 리포터 유전자 발현이 1로 3 시간 후에 감지 수 있습니다 운전하는 데 사용되는 모터에 따라 다릅니다. </li><li> 같은 경우에는 그것이 30-60 분 구슬로 세포를 부화 필요할 수 있습니다 다음, 비법인 구슬을 제거하고, 시간의 추가 기간을 위해 세포를 잠복기 전에 새로운 미디어를 추가하는 PBS 2 세척 할. </li></ol> 듀얼 GloTM 루시페라제 어세이 <ol><li> 참고 :이 키트를 사용을위한 프로토콜은 제조 업체에서 권장하는 것과 몇 가지 측면에서 다릅니다. 이것은 샘플 당 필요한 시약의 양을 줄이기 위해 수정되었습니다. </li><li> -20 ˚ C. 여러 작은 aliquots 및 저장에 1 M DTT, 분할의 솔루션을 준비 </li><li> 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.8), 10 % (V / V) 글리세롤, 그리고 0.5 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 용해 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에, 나누어지는 실험에 필요한 금액과 1X로 0.5의 최종 농도 1 M DTT 플러스 테아제 억제제 칵테일의 ML 당 1 μl를 추가합니다. 남은 DTT 솔루션을 재사용하지 마십시오. </li><li> 처음으로 듀얼 GloTM 키트를 사용할 경우, 듀얼 GloTM 루시페라제 기판 한 병 (제공하는 듀얼 GloTM 루시페라제 버퍼 한 병 (키트와 함께 제공)의 전체 내용을 전송하여 (반딧불) 루시페라제 시약 준비 키트와 함께). -20 ˚ C. 10 - ML aliquots 및 저장에 사용하지 않는 루시페라제 시약 디비드 </li><li> 조직 문화의 인큐베이터에서 96 - 웰 플레이트를 제거하고 얼음에 놓으십시오. 흡인하여 미디어를 제거, 40 μl 당 우물의 용해 버퍼를 추가한 다음 30 분 얼음 접시를 두십시오. </li><li> 잘 루시페라제 시약의 다음 당 흰색, 불투명한에서 96 - 웰 플레이트 (OptiplateTM - 96, 퍼어킨 엘머 카탈로그 번호 6005290) 나누어지는 15 μl은 세포 lysate 15 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 실온에서 접시를 부화 후 microplate 리더의 발광을 읽어보십시오. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 1 일부 듀얼 GloTM 스톱 &amp; 글로을 추가하여 Renilla 루시페라제 기판 솔루션의 적절한 금액을 준비 ®; 시약 (키트와 함께 제공) 100 부품 듀얼 GloTM 스톱 &amp; 글로 ® 버퍼 (키트와 함께 제공)합니다. </li><li> 각 물론 10 분에 대해 실온에서 품어 Renilla 루시페라제 기판 솔루션을 15 μl 당 우물을 추가 후 다시 발광을 측정합니다. </li></ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 biogenesis 유학

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

멤브레인 biogenesis 동안 다른 지질 합성 경로의 조정을 연구하기 위해 그것은 멤브레인 biogenesis 빠르게하고 inducible 방식에서 발생하는 실험 시스템을 작동하는 데 유용합니다. 우리는 세포가 빠르게 입자 engulfment 동안 자료를 배치로 손실 막 풀을 보충 막 lipids를 종합으로 라텍스 구슬의 phagocytosis가 이러한 목적을 위해 실용적인 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 Promega에서 듀얼 글로 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

막 생합성 과정 중 서로 다른 지질 합성 경로의 협응을 연구하기 위해서는, 막... 이 조절되는 실험 체계를 활용하는 것이 유용합니다.

안녕하세요, 저는 기억과 생합성을 위한 다양한 지질 합성 경로의 조율을 연구하는 IL OV입니다. 막 생합성이 빠르게 일어나고 유도되는 실험 시스템을 갖추는 것은 매우 유용합니다. 저희는 라텍스 비드의 식세포 작용이 이러한 연구에 특히 유용하다는 것을 발견했는데, 이는 세포가 포식 과정 초기에 래핑 물질로 소실된 막을 보충하기 위해 새로운 막을 매우 빠르게 합성하기 때문입니다.이 영상에서 제 동료인 Ong Zang이 Luciferase 기반 리포터 분석법을 사용하여 식세포 작용으로 유도된 유전자 발현 변화를 연구하는 절차를 시연하겠습니다. 안녕하세요, 저는 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과의 X입니다. 오늘은 리포터 유전자 분석법을 사용하여 식세포 작용 후 막 생합성에 관여하는 유전자의 조절을 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.본 실험 과정에서는 인간 배아 신장 293 세포 배양물을 사용합니다. 이 세포들은 Basal Modified Eagle's Medium(DMEM)에 10% fetal bovine serum(FBS)과 항생제 칵테일을 첨가한 배지 A가 담긴 10 cm 배양 접시에서 배양됩니다. 표준화 기술을 사용하여 접시 바닥에서 세포를 떼어내어 수를 센 후, 폴리라이신이 코팅된 96-well 플레이트에 분주하여 transfection 시작 전까지 24시간 동안 배양합니다.형질전환의 경우, 모든 조건을 통상적으로 3회 반복 수행하며, 웰당 총 50~100 ng의 플라스미드 DNA를 형질전환합니다. 플라스미드 혼합물에는 firefly luciferase를 발현하는 리포터 컨스트럭트와 구성적 프로모터(constitutive promoter)로부터 renal luciferase를 발현하는 컨트롤 플라스미드가 최소한으로 포함되어야 합니다. 우선, serum-free 및 antibiotic-free DMEM에 trans293 형질전환 시약을 혼합하여 준비합니다. 형질전환할 각 웰마다 10 µL의 DMEM을 사용하고, 플라스미드 DNA 1 µg당 3 µL의 trans293 시약을 첨가합니다.예를 들어, 200 µL의 DMEM에 3 µL의 trans 2 9 3 시약과 50 ng의 DNA를 사용하여 트랜스펙션을 수행할 웰 20개를 준비하는 경우입니다. 용액을 피펫팅으로 반복해서 섞은 후, 실온에서 최소 5분 동안 그대로 둡니다. 그다음, DNA를 각각의 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 보통

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연구

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Biology

생물학

줄기 세포 요법에 대한 관심이 점점으로, 분자 이미징 기술은 이식 후 모니터링 줄기 세포 행동에 이상적입니다. 루시페라제 리포터 유전자는 세포 생존, 위치 및 생체내의 확산의 비침습, 반복적인 평가를 활성화합니다. 이 동영상은 살아있는 마우스의 hESC 확산을 추적하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

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이 동영상은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분할 루시페라제 보체 분석을 보여줍니다. 이 분석법에서 관심 단백질은 루시페라아제 효소의 작은 단편과 큰 단편에 태그가 지정됩니다. 단백질이 상호 작용할 때 큰 조각과 작은 조각이 결합하여 활성 효소 복합체를 형성하며, 특정 기질이 존재할 때 측정할 수 있는 밝은 발광을 방출합니다.

특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

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집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

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유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

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신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.

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루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

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