루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

안녕하세요, 저는 기억해야 할 다양한 지질 합성 경로의 조정과 생물 발생을 연구하기 위해 IL OV입니다. 막의 생물발생이 빠르게 일어나고 유도되는 실험 시스템을 갖추는 것이 유용합니다. 우리는 라텍스 비트의 식세포작용이 이러한 연구에 특히 유용하다는 것을 발견했는데, 그 이유는 세포가 새로운 막을 매우 빠르게 합성하여 삼킴 과정 초기에 포장 재료로 손실된 막을 보충하기 때문입니다.

이 비디오에서 제 동료 Ong Zang은 하버드 대학의 분자 및 세포 생물학과에서 엑손 노스의 레버리지에서 X입니다. 오늘은 report gene assay를 사용하여 phagocytosis 후 membrane biogenesis에 관여하는 유전자의 조절을 분석하는 방법을 보여 드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 위해 우리는 인간 배아 신장 2 93 세포의 배양을 사용합니다. 이 세포는 10% 태아 B 혈청 또는 FBS와 항생제 칵테일이 보충된 베일, 변형 독수리, 자아 매체 또는 DMM으로 구성된 배지 A의 10cm 배양 접시에서 성장합니다. 표준화 기술을 사용하여 세포를 접시 바닥에서 분리하고 카운터를 만든 다음 96개의 웰 플레이트에 폴리리신으로 코팅된 플레이트에 도금하여 거래를 시작할 때까지 24시간 동안 성장시킵니다.

transfection의 경우, 당사는 일상적으로 모든 조건을 3회 및 transfection, 총 50-100 및 웰당 나노그램의 플라스미드 DNA로 수행합니다. Plaid mixes는 적어도 firefly luciferase를 발현하는 reporter construct와 constructitutive promoter로부터 신장 lucifer를 발현하는 control plasmid를 포함해야 합니다. 먼저, trans 2 N 3 transfection 시약과 함께 혈청 프레임과 항생제 프레임 DM EM의 혼합물을 준비하고, transfection할 각 웰에 대해 10 μlit의 DMM을 사용하고, plasmid DNA 마이크로그램당 3 μl의 trans 2 9 3 시약을 사용합니다.

예를 들어, 각각 20 웰을 3 마이크로리터의 트랜스 2 9 3 시약에서 200 마이크로리터의 DM EM으로 50 나노그램 DNA로 형질 주입하는 경우. 용액을 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 혼합한 다음 최소 5분 동안 실온에서 방해받지 않고 방치합니다. 다음으로, DNA는 별도의 마이크로 원심분리 튜브에 파이프로 삽입됩니다. 플러스 미터 원액의 농도는 일반적으로 마이크로리터당 10에서 100나노그램 사이입니다.

DM M transit mixture가 5분 동안 배양되면 DNA tube로 옮기고 용액을 피펫팅으로 다시 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 20분 동안 그대로 둡니다. 20분 삽관 동안 96 웹 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 10마이크로리터의 D-M-M-D-N-A에서 배양이 완료되면 각 웰에 3개의 혼합물로 변환하면 19마이크로리터의 새로운 배지 A로 교체합니다.

혼합물을 기존 액체에 직접 피펫으로 주입해야 합니다. 피펫 팁이 튜브 벽에 닿지 않도록 하십시오. 검사하지 않고 남겨둘 3개의 세포 웰을 포함하는 것도 중요합니다.

이 웰의 평균 루시퍼라제 활성은 나중에 배경에서 96 웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 세포를 성장시킬 때 뺍니다. 24시간 배양이 완료되면 막생합성을 유도하여 느슨한 비드의 생합성을 진행합니다. 시작하려면 세포 배양 배지와 느슨한 비드를 포함하는 현탁액을 준비합니다.

이를 위해 DM EM과 대마의 일대일 혼합 혼합물인 배지 B, F 용어 배지와 항생제 및 10% FBS를 준비합니다. 그런 다음 0.75 미크론 느슨한 비드에서 밀리리터당 최대 1밀리그램의 농도로 비드를 만듭니다. 물론 모든 실험에는 비드가 첨가되지 않은 대조군이 포함되어야 합니다.

다음으로, 96웰 배양 플레이트에서 매체를 제거하고 각 웰을 100마이크로리터의 비드 현탁액으로 교체합니다. 일단 현탁액이 추가되면, 1000 G.This에 2 분 동안 판을 회전시키십시오.이것은 우물의 바닥에 구슬을 집중시키고 phagocytosis를 촉진합니다. 다음으로, 37°C에서 6-16시간 동안 세포를 포획합니다.

조건과 루시페라아제 증가를 유도하는 데 사용되는 프로모터에 따라 프로모터 유전자 발현은 1-3시간 후에 검출될 수 있습니다. 특정 실험의 경우, 예를 들어 정부의 입자에 영향을 주지 않고 지질 합성에 대한 특정 약물의 효과를 연구하기 위해 지질 합성에서 fal을 분리해야 할 수 있습니다. 이러한 경우, 세포가 비드를 사이토할 수 있도록 30-16분 동안 비트와 함께 세포를 배양합니다.

이 배양 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하여 통합되지 않은 비드를 제거합니다. 그런 다음 새로운 배지를 첨가한 다음 유전자 발현을 보고하기 위해 세포를 6-16시간 동안 배양합니다. 이제 철 분석을 진행할 준비가 되었습니다.

먼저 Lucifer 분석을 시작하기 위해 실험에 필요한 적절한 양을 사용하기 전에 2,000만 그루의 어금니, HCL, pH H 7.8, 10% 부피 대 부피 글리세롤 및 0.5% 부피 대 부피 트리톤 X 100을 포함하는 xis 완충액을 준비합니다. 그런 다음 1 몰 DTT의 밀리리터 당 1 마이크로 리터에서. 남은 DT T 용액을 재사용하지 마십시오.

그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일에서 듀얼 글로우 키트를 처음 사용할 때 최종 농도 0.5 대 1회, 듀얼 글로우 루시퍼 버퍼(dual glow lucifers buffer) 한 병의 전체 내용물을 듀얼 글로우 루시퍼라아제 기질 한 병에 옮겨 반딧불이 루시퍼 시약을 준비합니다. 사용하지 않은 루시페라제 시약을 10mm 쿼로 나누고 영하 20도에서 보관합니다. 루시페라제 시약이 준비되면 조직 배양 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 흡인에 의한 내측을 제거한 다음 용해 완충액 웰당 40마이크로리터를 추가하고 플레이트를 얼음 위에 30분 동안 그대로 둡니다.

다음으로, 웰당 15마이크로리터의 루시퍼 시약을 넣습니다. 흰색 불투명 96 웰 플레이트에서는 Perkin S 옵티브 플레이트 96을 사용합니다. 그런 다음 15 마이크로 리터의 세포에서 접시를 먹고 실온에서 10 분 동안 배양합니다.

10분 후 마이크로플레이트 리더에서 발광을 읽습니다. 다음으로, 대조군 플라스미드에 대한 toum 데이터를 위해 바닐라 루시퍼 분석을 수행합니다. 이렇게하려면 직전에 준비하고 1 파트 듀얼 글로우, 스톱 및 글로우 시약을 100 파트에 추가하여 적절한 양의 루시페라아제 기질 용액을 사용하십시오.

듀얼 글로우, 스톱 및 글로우 버퍼. 다음으로, 각각에 15 마이크로 리터의 기판 용액을 추가합니다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 잘 배양한 다음 발광을 다시 측정합니다.

이러한 이중 발광 철성 분석에 대해 제조업체에서 권장하는 프로토콜을 수정했다는 점에 유의하십시오. 프로 샘플에 필요한 시약의 양을 줄이기 위해 이제 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 다시 분석할 수 있습니다. 마이크로 플레이트 리더로 데이터를 수집하면 추가 분석을 위해 Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램으로 전송할 수 있습니다.

먼저, 절제되지 않은 3개의 우물에서 평균을 계산하고 각 데이터 포인트에서 해당 값을 뺍니다. 다음으로, transfected well각에 대해 반딧불이 luciferase에 대한 값을 나눕니다. 루시퍼라아제용으로 구입한 다음 각 삼중 샘플 세트에 대해 평균을 계산한 다음 편차와 변동 계수를 계산합니다.

이 예에서는 바닐라 루크레 활성에 대한 반딧불이의 비율에 대해 x축에 표시된 다양한 농도의 비드를 사용합니다. 보시다시피, 이 비율에는 용량 의존적 증가가 있습니다. 우리는 방금 루시퍼 기반 보고서, 유전자 분석을 사용하여 라텍스 속도의 식세포작용에 대한 반응으로 LDL 수용체 프로모터의 발현을 측정하는 방법을 보여주었습니다.

이 절차를 수행할 때 세포가 transfection의 80-90%만 합류한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.