Name: Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 Xenopus laevis 난모세포에서 이온 채널 패치 클램프 기법으로 기가옴 봉합 형성 및 outside-out 구성 설정 방법을. 이 기법은 전기생리학 연구에 필수적입니다.

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축소 솔루션 제조법은 RW 알드리치의 연구실에서입니다. 보건 국립 연구소, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 미국 심장 협회, 근육질 영양 장애 협회, 도널드 B.와 델리아 E. 백스터 재단 Klingenstein 기금과 신경 과학에 대한 맥나이트 엔다우먼트 : 우리는 지원을위한 다음과 같은 자금 지원 기관 및 재단 감사드립니다.

1 부 : vitelline 막 제거 <ol><li> 포셉 두 세트를 준비합니다. 우리는 한 세트가 약간 파일을 날카롭게되어 제 5 포셉를 선호합니다. 또한 7 &quot;파스퇴르 피펫을 트리밍하고 불을 연마하여 유리 전송 피펫을 준비합니다. </li><li> 추천 : 늑대의 oocytes을 방지하기 위해, 그리드의 서클 (1mm의 사각형)을 잘라 60mm 페트리 접시의 바닥에 접착제. 사용하는 사이에 청소 보관하면이 음식은 무기한으로 활용할 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경 hyperosmotic 솔루션 (제조법 참조) 장소 중간 페트리 접시를 채우십시오. </li><li> 그릇에 광택 파스퇴르 피펫과 장소와 함께 자신의 인큐베이션 솔루션 1-3 Xenopus의 oocytes를 제​​거합니다. </li><li> 정 잠깐 만요 - 전지 2 분을 축소하기 시작합니다. 긴 시간은 껍질에 세포가 쉽게, 짧은 시간이 패치에 대한 건강한 세포로 이어집니다. </li><li> 셀 축소로 vitelline 막의 세포 위에 투명한 레이어로 거의 표시되기 시작합니다. 필링에 대한 건강한 세포 (whorls 또는 결함없이)를 선택합니다. </li><li> 포셉 한 쌍의로 부드럽게 플라즈마 막을 손상시키지 않고 vitelline 막를 파악. 다른과 함께 같은 장소 근처에 파악하고 부드럽게 떨어져 맑은 멤브레인 찢어하고 세포의 무료입니다. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 녹화 실로 셀 이동합니다. 셀 vitelline 제거 후 연약됩니다. </li></ol> 2 부 : Gigaseal 세대 <ol><li> 식염수에 기록 피펫을 입력합니다. 피펫 커패시턴스를 최소화하기 위해 전극 와이어 잘 전기적 접촉을 만드는 솔루션의 최소 볼륨을 사용합니다. </li><li> 거품이 전극 와이어에 부동 및 슬라이드 수 있도록 피펫 여러 번 버려. 채워진 피펫에 압력을 적용합니다. 이것은 입이나 애완 동물 가게에서 수족관 펌프로 할 수 있습니다. 이 압력은 액체 인터페이스와 세포로 이동을 교차으로 피펫은 청소 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 챔버에서 oocyte를 찾아 세포의 가장자리에 크게 중점을두고 있습니다. </li><li> 목욕, 중심 세포 위에 (초점) 팁 밖으로 피펫으로. 이 최소화 시간은 인감 생성하기 전에 욕조에 보냈습니다. </li><li> 셀 옆에 선명하게 피펫을 드롭 다운. 근접 (~ 50 미크론)로 가져와. 이 솔루션의 작은 변형이 다시 압력에 의한 피펫 밖으로 밀려납니다. </li><li> 패치 클램프 소프트웨어를 사용하여 피펫의 저항을 확인 (우리의 목표는 약 3-4 MΩ입니다)와 오프셋 전압을 사용하여 전류를 제로. </li><li> 시각 저항을 모니터링이나 주파수 저항에 비례하는 음색을 생성 오디오 모니터를 사용하면서 피펫에 긍정적인 압력으로, 세포쪽으로 천천히 팁을 이동합니다. 팁이 세포를 만져 시작으로, 저항은 증가합니다. </li><li> 갑자기하지만 부드럽게 거의 동일한 절대값의 부정적인 압력에 긍정에서 전환합니다. 저항이 형성 밀봉을 증가한다. </li><li> 시간의 대다수는, 인감 형성은 몇 초 이내에 발생, 가끔 30-60초이 필요합니다. </li><li> 저항 1GΩ에되면, 압력은 중립에 공개하실 수 있습니다. 이제 온 세포 패치를했습니다. 내부 아웃 패치, 빠르게 세포에서 멀리 당기십시오. 외부 출력은 아래를 참조하십시오. </li></ol> 제 5 부 : 외부 아웃 토폴로지 (옵션) <ol><li> 즉시 gigaseal, 파열 멤브레인 달성 후. 이것은 날카로운 흡입과 함께 할,하지만 우리가 한 MS에 1 V 펄스를 선호하실 수 있습니다. 저항은 초기 피펫의 저항보다 약간 더 많은 드롭한다. </li><li> 멀리 천천히, 그리고 부드럽게 세포에서 피펫을 이동합니다. 당신은 피펫으로 세포 당겨의 섹션을 참조해야합니다. 갑자기, 그리고 몇 초 이내에, 세포는 다시 스냅되고 저항은 즉시 동시에 GΩs로 돌아합니다. </li><li> 이제 외부 출력 구성에 패치를했습니다. 모든 포함된 이온 채널의 ectodomains은 목욕에 노출됩니다. </li></ol> 파트 6 : 예상 결과 일반적으로, 높은 저항 물개가 선호하고 더 이상 살고있다. 10 GΩ 품질이 우수한 밀봉을위한 좋은 지침이다. 우리의 경험에서이 품질의 바다표범을 얻는 확률은 품질 특히 셀 및 피펫 많은 요인과 다를 수 있습니다. 패치 수집 요금은 건강한 세포, 깨끗한 pipettes, 그리고 경험 연구원 95 % 이상 수 있습니다. 이러한 패치는 몇 분 동안 마지막으로 단일 채널 녹음을 포함한 Xenopus oocytes의 표현 이온 채널의 electrophysiological 연구에 적합합니다.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

여기에 논의하지 electrophysiological 녹음 많은 매개 변수가 있습니다. 릭 설치, 시스템 소음 관리, 채널 표현 및 기록 프로토콜은 모든 좋은 실험 결과 또한 중요합니다. 우리의 경험에서, 이들은 안정적인 물개를 형성을위한 가장 중요한 파라미터 : 목욕을 입력하면 고품질 oocytes는 (일명, &quot;필링&quot;) 빠르게 vitelline 막 제거, 먼지로부터 보호 새로 가져온 pipettes 부드러운 pipettes, 적용 긍정적인 압력을 사용하여 솔루션 이전 실링에 욕조에 짧은 시간. 이되는 경험을 광범위하게 다양하고 다른 사람이 가장 중요한 요소 중 자신의 세트를 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>패치 클램프 증폭기 &amp;소프트웨어</td><td>기기</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>또는 다른 유사한 장치(예: HEKA EPC-9 또는 Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>5번 포셉 (두 쌍)</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>난자 수축 용액</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>성분 함량
N-methyl-D-glucamine 220mM
HEPES 10mM
MgCl2 1mM
EGTA 10mM
Aspartic Acid 220mM
KCl 2mM
pH를 N-methyl-D-glucamine으로 7.4로 조정</td></tr><tr><td>직조 메시</td><td>800 $\mu\text{m}$</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Sakmann 및 Neher 1, 2에 의해 개발 이후, 패치 클램프 세포에서 하나 또는 여러 개의 이온 채널의 electrophysiological 측정을위한 매우 유용한 기술로 설립되었다. 이 기술들은 기본 환경 모두에서 이온 채널에 적용 및 아프리카 발톱 개구리, Xenopus laevis oocytes에서 수확으로 heterologous 세포에 표현할 수있다. 여기, 우리는 Xenopus의 oocytes에서 패치 클램프 녹음의 잘 설립 기법을 설명합니다. 이 기술은 개별적으로 인구 (macropatch) 또는 (단일 채널 녹음)에 어느 표현 이온 채널의 속성을 측정하는 데 사용됩니다. 우리는 oocyte 준비 및 인감 세대의 품질을 극대화하기 위해 기술에 중점을두고 있습니다. 모든 요소가 최적으로,이 기법은 90 % 이상 성공 인감 세대의 가능성을 제공합니다. 과정은 그 또는 그녀가 가장 중요한 발견 요인에 따라 모든 연구자가 다르게 최적화, 우리는 우리 손에 가장 큰 성공으로 이어질있는 방법을 제시 수도 있습니다.

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Sakmann과 Neher 1, 2에 의해 개발된 이후, 패치 클램프(patch clamp)는 전기생리학적 연구를 위한 매우 유용한 기술로 자리 잡았습니다...

본 절차는 패치 클램프 기록에 필수적인 기가옴(giga ohm) 저항 씰을 성공적으로 형성하기 위해 Opus Cytes에서 빌린(vilin) 막을 제거하는 것으로 시작합니다. 온-셀(on-cell) 패치 클램프 구성이 완료되면, 피펫에 흡입력을 가하여 세포질에 전기적으로 접근할 수 있는 홀-셀(whole-cell) 패치 구성으로 전환할 수 있습니다. 이후 피펫 팁을 세포막에서 서서히 떼어내어 막이 떨어져 나가게 함으로써, 채널의 외 도메인이 배양액에 노출되는 작은 막 조각을 얻을 수 있으며, 이를 아웃사이드-아웃(outside-out) 패치 구성이라고 합니다. 안녕하세요, 저는 스탠포드 대학교 분자 및 세포 생리학과 Miriam Goodman 박사 연구실의 Austin Brown입니다.저는 Goodman Lab의 Brandon Johnson입니다. 이전 영상에서 저희는 전기생리학을 위한 패치 클램프 피펫과 샤프 전극의 제작 방법을 시연했습니다. 오늘은 zpa에 발현된 이온 채널의 패치 클램프 기록법에 대해 소개하겠습니다.1970년대 후반 S Sacramento와 Air에 의해 개발된 이후, 패치 클램프 기록법은 세포 내 단일 또는 다중 이온 채널의 전기생리학적 측정을 위한 필수적인 기술로 자리 잡았습니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 패치 클램프 피펫이 난모세포의 세포막에 접근하기 위해서는 외부의 투명대(vitelline membrane)를 제거해야 합니다.이를 위해 먼저, 5번 포셉 두 세트를 준비합니다. 포셉 한 세트는 줄(file)을 사용하여 끝을 약간 날카롭게 만듭니다. 또한, 7인치 파스퇴르 피펫을 다듬고 화염 연마하여 유리 전송 피펫을 준비합니다. 세포가 미끄러지는 것을 방지하기 위해, 0.8 millimeter 격자 크기의 메쉬 그리드에서 원형으로 조각을 잘라 60 millimeter 페트리 접시 바닥에 접착제로 붙입니다.이 배양 접시는 사용 사이에 청결하게 유지한다면 무기한으로 재사용할 수 있습니다. 그런 다음 페트리 접시의 절반을 고삼투압 용액으로 채우고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 이제 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 배양액에서 1~3개의 opus Cytes를 꺼내 접시에 넣습니다.세포가 수축하기 시작할 때까지 15초에서 2분 정도 기다립니다. 세포가 수축함에 따라, vilin 막이 세포 위의 투명한 층으로 희미하게 보이기 시작할 것입니다. 대기 시간이 길어지면 세포를 벗겨내기가 더 쉬워지며,

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<em&gt; Xenopus의</em형광 측정으로&gt; 난자 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술

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배우세요 Xenopus laevis 난모세포에서 이온 채널 패치 클램프 기법으로 기가옴 봉합 형성 및 outside-out 구성 설정 방법을. 이 기법은 전기생리학 연구에 필수적입니다.

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