Name: 프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 배우세요 프로그래머블 풀러를 사용하여 패치 클램프 피펫과 샤프 전극을 만드는 방법을. 왁스 코팅과 화염 연마 기술을 통해 고품질 유리 전극을 제작하여 전기생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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보건 국립 연구소, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 미국 심장 협회, 근육질 영양 장애 협회, 도널드 B.와 델리아 E. 백스터 재단 Klingenstein 기금과 신경 과학에 대한 맥나이트 엔다우먼트 : 우리는 지원을위한 다음과 같은 자금 지원 기관 및 재단 감사드립니다.

풀링 pipettes 풀러 등 서터 P - 97 플라밍 / 브라운으로 microelectrode를 사용하여 약 10-20 pipettes 세트를 가져옵니다. <ol><li> 당신의 모세관 유리를 선택합니다. 우리는 borosilicate 모세관 (서터 BF150 - 110 - 10, 1.5mm 외경, 내경 1.1mm, 길이 10cm)을 사용합니다. 그것이 깨끗하고 먼지가 무료로 남아 있도록 신중하게 유리를 저장합니다. </li><li> 당기는 프로그램을 디자인합니다. 우리는 내림차순 열과 속도의 각 단계에서, 그리고 마지막 단계에있는 작은 당겨와 5 단계 프로그램을 사용합니다. 서터의 피펫 요리책은 적합한 프로그램을 개발하기위한 훌륭한 레퍼런스입니다. </li><li> 개방 직경과 매끄러운를 결정하는 현미경 피펫 팁을 검사합니다. 거친 고르지 또는 불규칙 조언을​​ 폐기하십시오. 좋은 당기는 프로토콜이가 드문 있도록해야합니다. 표준 패치 - 클램프 녹음, 팁 구멍은 직경 1-3 미크론해야합니다. 가파른 테이퍼 (뭉툭한 끝)은 같은 오프닝 직경에 대한 저항을 낮은 발생합니다. 모양과 크기가 압력 연마에 의해 수정할 수 있습니다. </li></ol> 소방 연마 pipettes <ol><li> 발 페달에 의해 통제 플래티넘 가열 필라멘트와 연마 장비 (microforge)를 설정합니다. 유용한 키트 에이러 과학 (CPM - 2) 또는 이와 유사한기구가 조금씩 조립하실 수 있습니다. </li><li> 옵션 : 코트 용량을 감소 및 소음 특성을 개선하기 위해 절연체로 피펫. 우리는 치과 왁스를 사용합니다. Sylgard 184 ™은 (또한 PDMS로 알려진 폴리 디메틸 실록산 - 엘라스토머)도 옵션입니다. </li><li> 왁스를 사용하는 경우, 작은 용융 공급이 근처에 보관. 피펫을 입력에서 왁스를 유지하기 위해 피펫의 뒷면에 공기 압력으로 액체 왁스에 팁 잠시을 찍어 제거합니다. Sylgard으로 저장, 준비 냉동 aliquots의 탄성과 현미경 피펫 팁을 페인트. 탄성체를 치료하기 위해 열. </li><li> 연마 장치에 피펫을 (코팅 여부) 장소 및 팁에게 필라멘트에서 ~ 50 미크론 가져. 가열하면 필라멘트가 확장됩니다 유의하십시오. </li><li> 추천 : 최적의 저항과 팁 직경에 대한 피펫의 모양을 변경하려면 &quot;압력 연마&quot;에 대한 별도의 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 간단한 열 펄스 (1~2초)는 피펫의 팁을에서 왁스를 제거하고 유리를 부드럽게하기 위해 충분하다. </li><li> , 먼지로부터 보호하기 10 성공 pipettes을 반복하는 닫힌 상​​자에 완성된 피펫를 놓습니다. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

프로토콜 그림 여기에 전기 생리학 실험실에서 일상 사용되고 또한 세포 및 동물 주입 바늘을하는 데 사용됩니다. 프로그램 풀러와 함께, 그것은 사용의 다양한 pipettes를 만들기 위해 쉽습니다. 관심과 관리를 통해 귀하의 풀러의 필라멘트는 1 년 이상 지속됩니다. 실험과 함께 행운을 빕니다.

<table><tbody><tr><td>마이크로피펫 풀러(Micropipette Puller)</td><td>기기</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>또는 유사한 기기 (예: Sutter P-87 또는 P-2000)</td></tr><tr><td>유리 모세관(Glass Capillaries)</td><td>시약</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>또는 유사한 모세관 유리. 피펫 충전을 용이하게 하려면 유리 필라멘트가 포함된 모세관을 사용하십시오.</td></tr></tbody></table>

프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

유리 microelectrodes는 (또한 pipettes라고도 함) 수십 년 동안 전기 생리학의 일하는 말이되어 왔습니다. 오늘날과 같은 pipettes은 프로그램 풀러를 사용하여 유리 모세관에서 만들어집니다. 이러한 악기 열 금속 필라멘트 또는 레이저와 중력, 모터 또는 둘 모두를 사용하여 유리를 그릴 중 하나를 사용하여 모세관. 세포내 레코딩을위한 날카로운 전극은 열, 중력, 그리고 모터의 조합을 사용하는 동안 패치 - 클램프 녹음 Pipettes은 단 열과 중력을 이용하여 형성됩니다. 세포내 기록 pipettes를 만들기 위해 사용되는 절차는 Xenopus의 oocytes에 cRNA 분사를 포함한 다양한 어플 리케이션을위한 주사 바늘을 만들기 위해 사용하는 것과 비슷합니다. 좁은 유리 세포 기록 (외경 = 1.0 ㎜)에 사용되는 동안 일반적으로, 모세관 유리에 직경 &lt;1.2 mm은 패치 클램프 녹음 pipettes을하는 데 사용됩니다. 각 도구에 대한, 풀러가 약간 다르게 프로그램입니다. 이 비디오는 사전에 설립 풀러 프로그램을 사용 기록 pipettes 두 가지를하는 방법을 보여줍니다.

이 동영상은 전기 생리학에 대한 패치 pipettes과 날카로운 전극을 만들 수있는 프로그램 풀러를 사용하는 방법을 보여줍니다. 동일한 절차는 주사 바늘을 포함한 유리 다양한 도구를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

유리 미세전극(피펫이라고도 함)은 수십 년 동안 전기생리학의 핵심 도구로 사용되어 왔습니다. 오늘날 이러한 피펫은 유리 모세관으로 제작됩니다...

유리 모세관 피펫은 단일 세포 전기천공법, DNA 미세주입 및 패치 클램프 전기생리학과 같은 매우 다양한 기술을 위해 실험실에서 보편적으로 사용되고 있습니다. 기록을 위한 유리 모세관 패치 클램프 전극을 준비하기 위해, 프로그래밍 가능한 풀러(puller)에서 규산염 유리를 가늘게 뽑아냅니다. 전극 팁을 왁스로 코팅한 다음, 팁을 화염 연마하여 추후 사용을 위해 보관합니다. 안녕하세요, 저는 스탠퍼드 대학교 분자 및 세포 생리학과의 Miriam Goodman입니다.이 영상에서는 전기생리학을 위한 패치 클램프 피펫과 날카로운 전극(sharp electrodes)을 제작하는 방법을 시연하겠습니다. 피펫이라고도 불리는 유리 미세 전극은 수십 년 동안 전기생리학의 핵심 도구로 사용되어 왔습니다. 오늘날 이러한 피펫은 프로그래밍 가능한 풀러(puller)를 사용하여 유리 모세관으로 제작합니다.이제 시작하겠습니다. 패치 클램프 피펫을 제작하기 위해 깨끗하고 먼지가 없는 Sutter 보로실리케이트 모세관과 Sutter P-97 화염 연마 마이크로 전극 풀러를 사용합니다. 적절한 풀링 프로그램을 개발하는 데에는 Sutter의 피펫 쿡북(Pipette Cookbook)이 훌륭한 참고 자료가 됩니다.시작하려면 풀러의 먼지 덮개를 들어 올리십시오. 그런 다음 상자에서 유리 모세관 튜브를 하나 꺼냅니다. 먼지가 쌓이는 것을 최소화하기 위해 뚜껑을 반드시 다시 닫아주십시오.다음으로, 한 손으로 모세관을 필라멘트 한쪽의 홈으로 밀어 넣고 클램프를 약간 조입니다. 이때 클램프는 튜브가 떨어지지 않을 정도로 충분히 조여져 있어야 하지만, 홈 안으로 밀어 넣을 수 있을 만큼은 느슨해야 합니다. 이제 동일한 쪽에 있는 스프링 금속 스토퍼를 풉니다.그런 다음 엄지와 검지로 두 캐리어 하단에 부착된 금속 탭을 잡습니다. 반대편의 스프링 금속 스톱을 풉니다. 캐리어들을 최대한 가까이 당겨 한 손으로 고정합니다.다음으로, 튜브를 필라멘트 하우징을 통해 반대편 캐리어의 홈으로 밀어 넣습니다. 유리가 가열 필라멘트로 밀려 들어가지 않도록 주의하십시오. 양쪽의 클램프를 조입니다.캐리어를 고정할 수 있을 만큼 충분히 조여야 하지만, 유리가 깨질 정도로 너무 세게 조여서는 안 됩니다. 이제 먼지 덮개를 닫고 녹색 버튼을 누르십시오. 패치 클램프 기록용의 표시된 폴 피펫은 각 단계마다 열과 속도가 감소하고 마지막 단계에서 작은 폴을 형성하는 5단계 폴링 프로그

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 유리 micropipettes의 모양을 수정하는 가이드입니다. 특히, 열 및 공기 압력을 사용하여 테이퍼가 낮은 피펫 저항을 선도 팁 오프닝을 증가하지 않고 확대됩니다. 이것은 작은 세포의 낮은 소음 녹음을 얻는 것이 중요합니다하지만 많은 응용 프로그램에서 유용합니다.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

평면 지질 bilayers, 또한 불리는 인공 지질 bilayers, 당신이 공부할 수 있도록 이온 실시하는 잘 정의된 환경에서 채널을. 여기, 우리는 이중층 챔버를 준비하는 데 필요한 각 단계의 전극 및 이중층은 단일 채널 측정에 적합한 것을 테스트를 보여줍니다.

전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비

고효율을위한 신뢰할 수있는...

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

세포 중 신경 agonists과 antagonists의...

에 대한 Multibarrel 전극을 제조 및 꽃돼지 - 다시 사용<em&gt; 생체에</em신경 응답&gt; 약리 노는

다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

깨어 있는 쥐의 기록 부위 부근에서 세포 외 신경 활동을 동시에 기록하고 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극 구성 방법을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 관심 있는 뉴런에 대한 추정 국소 시냅스 입력값을 자세히 분석할 수 있습니다.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

이 프로토콜은 표준 시험관 전기 생리학 장비를 위해 최근에 개발 된 시스템을 사용하여 자동 이미지 유도 패치 클램프 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.

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우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

배우세요 프로그래머블 풀러를 사용하여 패치 클램프 피펫과 샤프 전극을 만드는 방법을. 왁스 코팅과 화염 연마 기술을 통해 고품질 유리 전극을 제작하여 전기생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

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