프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

유리 모세관 피펫은 단일 세포 전기천공법, DNA 미세주입 및 패치 클램프 전기생리학과 같은 다양한 기술을 위해 실험실에서 유비쿼터스가 되었습니다. 기록을 위한 유리 모세관 패치 클램프 전극을 준비하거나 규산염 유리를 프로그래밍 가능한 극성에 끌어당깁니다. 전극 팁은 왁스로 코팅된 다음 팁은 화재 광택 처리되어 나중에 사용할 수 있도록 보관됩니다. 안녕하세요, 저는 스탠포드 대학의 분자 및 세포 생리학과의 미리암 굿맨(Miriam Goodman)입니다.

이 비디오에서는 전기 생리학을 위한 패치 클램프 피펫과 날카로운 전극을 만드는 방법을 시연하겠습니다. 피펫이라고도 하는 유리 마이크로 전극은 수십 년 동안 전기생리학의 주력 분야였습니다. 오늘날 이 피펫은 프로그래밍 가능한 당김을 사용하여 유리 모세관으로 만들어집니다.

시작하겠습니다. 패치 클램프 피펫을 만들기 위해 깨끗하고 먼지가 없는 모세관에서 Sutter 멧돼지 실크를 사용하고 Sutter P nine seven 화염 접지 마이크로 전극 풀러를 사용합니다. Sutter의 피펫 요리책은 적절한 풀링 프로그램을 개발하기 위한 훌륭한 참고 자료입니다.

시작하려면 풀러의 먼지 덮개를 들어 올립니다. 그런 다음 상자에서 유리 모세관 하나를 꺼냅니다. 먼지 쌓임을 최소화하기 위해 뚜껑을 교체하십시오.

그런 다음 한 손으로 모세관을 필라멘트의 한쪽 면에 있는 홈으로 밀어 넣고 클램프를 약간 조입니다. 이 시점에서 클램프는 튜브가 떨어지는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 조여야 하지만 홈으로 밀어 넣을 수 있을 만큼 느슨해야 합니다. 이제 같은 쪽에 있는 스프링 금속 스톱을 해제합니다.

그런 다음 엄지와 검지로 두 캐리어의 바닥에 부착된 금속 탭을 잡습니다. 다른 스프링 금속 스톱을 놓습니다. 캐리어를 최대한 함께 당기고 한 손으로 제자리에 고정합니다.

그런 다음 필라멘트 하우징을 통해 튜브를 반대쪽 캐리어의 홈으로 밀어 넣습니다. 유리를 가열 필라멘트에 밀어 넣지 마십시오. cl을 조입니다.amp양쪽에 있습니다.

캐리어를 제자리에 고정할 수 있을 만큼 충분히 조여야 하지만 유리가 부서질 정도로 꽉 조여서는 안 됩니다. 이제 먼지 덮개를 닫고 녹색 버튼을 누릅니다. 패치 클램프 기록을 위한 표시된 폴 피펫은 각 단계에서 하강하는 열과 속도, 마지막 단계에서 작은 폴을 사용하는 5단계 폴링 프로그램을 사용하여 형성됩니다.

이 프로그램은 열과 중력을 사용합니다. 날카로운 전극을 만드는 절차는 매우 유사하지만이 경우 외경이 1mm이고 내경이 0.78mm 인 Warner Instruments의 얇은 유리 모세관을 사용합니다. 또한 당기는 프로그램이 끝나면 열과 중력 외에 모터를 사용하는 당기는 프로그램을 적용합니다.

먼지 덮개를 들어 올리고 두 클램프를 모두 풀고 완성된 피펫을 제거합니다. 그런 다음 피펫을 작업 상자에 넣습니다. 상자는 플라스틱 피펫 팁 상자의 랙에 폼 스트립을 붙인 다음 폼에서 6-8 개의 슬릿을 잘라서 만들 수 있습니다.

슬릿에 피펫을 삽입합니다. 상자에 당겨진 피펫이 가득 차면 화재 연마 단계로 진행하여 피펫을 연마합니다. 불 연마를 시작하기 전에 풋 페달로 제어되는 백금 가열 필라멘트가 있는 마이크로 단조 리그를 설정합니다.

먼저 피펫을 치과용 왁스로 코팅하여 커패시턴스를 줄이고 소음 특성을 개선합니다. 이렇게하려면 근처에 소량의 용융 왁스를 보관하십시오. 왁스가 팁에 들어가지 않도록 피펫 뒷면에 공기압을 가하십시오.

그런 다음 팁을 액체 왁스에 잠시 담그십시오. 그리고 지금 제거하십시오. 피펫을 연마 장치에 놓고 팁을 필라멘트에서 약 50미크론 정도 가져옵니다.

필라멘트는 가열되면 팽창한다는 점을 명심하십시오. 1-2초의 짧은 열 펄스를 가하여 피펫 끝에서 왁스를 제거하고 유리를 매끄럽게 합니다. 현미경으로 피펫 팁을 검사하여 개구부 직경과 부드러움을 측정합니다.

표준 패치 클램프 기록의 경우 팁 개구부는 직경이 1-3미크론이어야 하며, 팁을 버리거나, 거칠거나, 고르지 않거나, 불규칙해야 합니다. 완성된 피펫을 작업 상자에 넣고 뚜껑을 닫아 피펫을 먼지로부터 보호하고 10회 연속 피펫을 반복합니다. 프로그래밍 가능한 풀러를 사용하여 패치 클램프 피펫과 날카로운 전기를 만드는 방법을 보여 드렸습니다.

동일한 절차를 사용하여 최적의 패치 클램프 결과를 위한 주사 바늘을 포함한 다양한 유리 도구를 만들 수 있습니다. 실험 당일에 먼지가 없는 새 파이펫을 뽑고 실험 후 한 시간 이내에 연마하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 검사를 통해 피펫이 매끄럽고 광택이 났는지 확인하십시오.

opus 난모세포에서 발현되는 이온 채널의 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을 보여주는 다른 비디오를 시청하십시오. 좋아요, 그게 다입니다. 이제 파이펫 전문가가 되셨으며 실험에 행운을 빕니다.