성인 마우스의 후각 행동 테스트

Rodin 후각 체계 또는 후각은 점점 더 인기 있는 연구 분야가 되었습니다. 후각 민감도를 테스트하기 위해, 마우스를 베딩이 없는 케이지에서 순화시킨 후, 농도가 점차 증가하는 취기 물질이 묻은 여과지 조각에 노출시킵니다. 그 후 마우스가 여과지를 탐색하는 데 소비하는 시간을 기록합니다.

후각 선호도 테스트는 정확히 동일한 방식으로 수행됩니다. 다만, odorant의 농도를 높이는 대신 생쥐가 서로 다른 odorant를 탐색하는 데 소비하는 시간을 기록합니다. 안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 신경생물학과의 Dr.Rosalyn Siegel 연구실 소속 Rochelle Witt입니다.

안녕하세요, Siegel 연구소의 Jennifer Deno입니다. 오늘은 후각 테스트를 위한 두 가지 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 후각 민감도와 후각 선호도를 연구하기 위해 이 절차들을 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 후각 민감도 테스트 절차를 시작하려면, 베딩이 없는 깨끗한 케이지 4개를 준비하십시오. 케이지의 크기는 높이 8인치, 너비 10인치, 길이 18인치여야 합니다.

생물안전작업대 내에 네 개의 케이지를 일렬로 배치합니다. 그다음, 불투명 여과지를 사용하여 각 아레나 사이에 칸막이를 설치합니다. 이어서 마지막 칸막이에 검은색 포스터 보드를 배치하여 케이지의 측면과 바닥을 덮도록 합니다.

케이지 상단을 투명한 플렉시글라스로 덮어 아레나에 빛이 들어오게 합니다. 이제 피험자들의 순화 과정을 시작하십시오. 첫 번째 피험자를 첫 번째 케이지에 넣습니다.

15분 후, 첫 번째 피험자를 두 번째 케이지로 옮깁니다. Quatra side tb로 첫 번째 케이지를 세척합니다. 그다음 두 번째 피험자를 세척된 첫 번째 케이지에 넣습니다.

테스트 전까지 이후의 실험 대상들에 대해 이 과정을 반복하십시오. 실험 대상 중 한 마리를 네 번째 케이지에 넣고 15분 동안 추가로 순응시킵니다. 최종적으로, 처음 세 개의 케이지 각각에 실험 대상이 한 마리씩 순응되어 있어야 합니다.

이제 향기 샘플을 준비할 준비가 되었습니다. 향기 샘플은 피험자, 유전자형 또는 조건에 대해 알지 못하는 다른 연구자가 준비해야 합니다. 2인치 x 2인치 크기의 여과지 사각형을 적절한 수만큼 만들어 샘플 준비를 시작하십시오.

그 다음, 원추형 튜브에 미리 선택한 향료를 적절히 희석합니다. 마우스의 배경(background)에 따라 대조군과 실험군을 효과적으로 구별하기 위해 서로 다른 향료 희석 비율이 필요할 수 있음을 유의하십시오. 이러한 관찰 결과에 따라, 미경험 마우스를 대상으로 실험 테스트를 진행하기 전에 대조군과 유사한 피험자들을 통해 적절한 향료 희석 배율을 경험적으로 도출하는 것이 유용함을 확인하였습니다. 피넛 버터와 같은 소수성 샘플의 경우 오일을 용매로 사용하고, 그 외 모든 샘플에는 다른 용매를 사용하십시오.

증류수 보텍스를 사용하여 희석액이 적절히 혼합되었는지 확인하십시오. 다음으로, 케이지 끝부분 전체가 초점에 들어오도록 흄 후드 끝단에 디지털 비디오 녹화 장치를 설치하십시오. 카메라 설정이 적절한지 확인하기 위해 예비 영상을 촬영하십시오.

실험 노트에 희석액을 테스트할 순서를 기록하되, 각 시행마다 순서를 무작위로 정하도록 주의하십시오. 또한 피험체의 리터(litter) 번호와 식별 번호를 기록하십시오. 피험체가 아레나에서 15분 동안 적응을 마치면, 첫 번째 시행을 위한 준비를 시작하십시오.

원추형 튜브에서 첫 번째 희석액을 피펫팅하여 위아래로 섞어준 다음, 이를 필터 페이퍼 정사각형 위에 피펫팅합니다. 필터 페이퍼 표면의 약 85%가 덮이는 것이 가장 이상적입니다. 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 필터 페이퍼가 과하게 포화되지 않도록 합니다.

향기가 밴 여과지가 준비되었으므로, 첫 번째 후각 민감도 시험을 수행할 준비가 되었습니다. 시험을 시작하려면 비디오 녹화를 시작하십시오. 그런 다음 향기가 밴 여과지를 동물의 현재 위치 반대편 케이지 내에 배치하십시오.

타이머를 시작하십시오. 3분 후, 기록을 중단하고 향료를 제거합니다. 다음으로, 타이머를 다시 시작하고 두 번째 향료 샘플을 준비하십시오.

1분 후, 비디오 녹화를 시작하십시오. 이전과 마찬가지로, 동물의 현재 위치와 반대편 케이지 끝에 향기 샘플을 놓습니다. 각 향 농도 희석액과 각 피실험체에 대해 이 절차를 반복하며, 각 시행별 비디오 파일 번호를 기록하십시오.

후각 민감도 테스트를 보여드렸으므로, 이제 후각 선호도 테스트를 진행하십시오. 후각 선호도 테스트의 경우, 다음의 두 가지 약간의 수정 사항을 제외하고 후각 민감도 테스트에서 설명한 것과 동일한 절차를 따르십시오. 첫째,

하나의 미리 선정된 향에 대해 여러 희석액을 준비하는 대신, 유인 향과 혐오 향을 모두 준비하십시오. 둘째, 테스트할 희석 농도를 기록하는 대신, 각 시행에서 순서를 무작위화하여 테스트할 변수의 순서를 기록하십시오. 피험자의 습관화, 블라인드 연구자의 참여, 여과지에 향을 도포하는 과정, 그리고 각 시행의 시간 측정 비디오 녹화를 포함한 절차의 다른 모든 단계는 후각 테스트와 동일합니다.

후각 선호도 테스트가 완료되면 후각 테스트 점수 산정을 진행하십시오. 모든 후각 민감도 및 선호도 영상을 확보한 후, 일관성을 위해 피험자가 각 희석액이나 향을 탐색하는 데 소비한 총 시간을 측정하십시오. 분석의 객관성을 위해 블라인드 연구자가 영상을 분석하여 이 작업을 수행하도록 하십시오.

먼저 비디오를 미리 보고 다음 사항들을 기록해 두는 것이 도움이 됩니다. 거름종이를 아레나에 배치한 시점, 마우스가 거름종이에 접근하는 시점, 마우스가 거름종이를 탐색하는 시점, 그리고 거름종이를 처음 배치한 때로부터 3분이 경과한 시점을 확인하십시오. 마우스의 행동에 집중해야 할 시점을 미리 파악하면, 이후 검토 단계에서 총 탐색 시간을 더 정확하게 측정할 수 있습니다. 이제 비디오 전체를 다시 검토하십시오. 스톱워치를 사용하여 거름종이를 아레나에 배치한 후 3분 이내에 이루어진 모든 탐색 시간을 측정하십시오.

탐색 시간은 마우스의 코가 여과지로부터 1mm 이내에 있는 모든 시간으로 정의하며, 마우스가 여과지에 근접해 있더라도 능동적으로 탐색하고 있지 않은 시간은 포함하지 않는 것이 중요합니다. 총 탐색 시간에 종이를 씹거나 핥는 행동, 또는 종이 위에 앉아 있는 시간은 포함하지 마십시오. 후각 행동을 정확하게 분석하기 위해 이러한 규칙을 엄격하고 일관되게 준수하십시오.

비디오 기록을 검토하여 필터 페이퍼를 조사하는 데 소요된 총 시간을 확인한 후, 모든 비디오에 대해 분석을 반복하십시오. 다음은 후각 테스트의 대표적인 결과입니다. 첫 번째 차트는 후각 민감도 훈련 세션의 결과를 보여줍니다.

실험군 B 또는 대조군 A의 각 마우스를 필터 페이퍼에 적신 다섯 가지 서로 다른 희석 농도의 시나몬 추출물에 3분 동안 1회 노출시켰습니다. 필터 페이퍼를 탐색하는 데 소요된 총 시간을 측정하였으며, 이 차트는 후각 선호도 테스트 세션의 결과를 보여줍니다. 각 마우스는 필터 페이퍼에 적신 각각의 서로 다른 향에 3분 동안 1회씩 노출되었습니다.

거름종이를 탐색하는 데 소비된 총 시간을 평가했습니다. 지금까지 이러한 절차를 사용하여 성체 마우스의 후각 능력을 테스트하는 방법을 보여드렸습니다. 후각 능력을 정확하게 테스트하고 학습이나 기억과 같은 다른 능력이 영향을 주지 않도록 하려면, 경험이 없는 나이브(naive) 마우스를 사용하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.