향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

이 절차는 100배 배율에서 피펫 팁을 폴리싱 필라멘트 근처에 배치하는 것으로 시작합니다. 다음으로 공기압과 열을 가합니다. 필라멘트입니다.

피펫 팁이 확장되어 뭉툭한 모양의 팁이 형성됩니다. 팁의 입구 크기를 줄이려면 가열을 중단하십시오. 압력과 가열을 다시 끕니다.

안녕하세요, 저는 스탠포드 대학교 분자 및 세포 생리학과의 Miriam Goodman 박사 연구실 소속 Brandon Johnson입니다. 오늘은 패치 피펫의 압력 연마(pressure polishing) 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 C. elegans 뉴런의 이온 통로와 막 패치(membrane patch)를 연구하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 6개에서 10개 세트의 패치 피펫을 준비하십시오. 도움이 필요하시면 현지 전문가나 프로그래밍 가능 폴러(programmable polar)를 이용한 패치 피펫 및 샤프 전극 제작 시각화 실험 영상을 참고하시기 바랍니다.

절차를 시작하려면 압축 공기 라인의 압력을 약 40 PS.I로 설정하십시오. 그런 다음 압축 공기 라인을 4방향 제어 밸브에 연결합니다. 4방향 밸브에 적절한 길이의 플라스틱 튜브를 연결하고, 플라스틱 튜브의 자유단에 고압 피펫 홀더를 부착하십시오. 연마 작업에는 마이크로 포지 장치를 사용하십시오.

당사는 LA Scientific 사의 Ccpm two 키트를 사용합니다. 이 장비는 고압 피펫 홀더, 풋 페달로 제어되는 백금 가열 필라멘트, 그리고 10배 및 100배의 저배율 및 고배율 롱 워킹 디스턴스(long working distance) 공기 대물렌즈가 장착된 현미경으로 구성되어 있습니다. 프로토콜 진행 중에 피펫 입구를 관찰하는 것이 매우 중요하므로 이러한 대물렌즈가 이상적입니다.

다음으로, 압력 밸브가 꺼짐(off) 위치에 있는지 확인하십시오. 그 후 피펫을 피펫 홀더에 넣고 실험실 안전을 위해 피팅을 손으로 조여 고정하십시오. 피펫이 피펫 홀더에 단단히 고정되었는지 확인하십시오.

그렇지 않으면 공기압으로 인해 피펫이 홀더에서 튕겨 나갈 수 있습니다. 선택 사항으로, 정전 용량을 줄이고 노이즈 특성을 개선하기 위해 왁스와 같은 소수성 절연체로 피펫을 코팅할 수 있습니다. 이제 피펫 홀더를 마이크로 포지(micro forge)에 장착하고, 마이크로 포지의 10배 저배율에서 팁과 연마용 필라멘트가 모두 보이도록 피펫 홀더를 현미경 스테이지 위에 배치하십시오.

팁을 필라멘트로부터 약 50 microns 거리까지 가져온 다음, 100배 고배율 대물렌즈로 전환하여 피펫 팁과 연마용 필라멘트가 모두 초점이 맞고 시야 내에 들어오게 합니다. 만약 그렇지 않다면, 필라멘트의 높이를 조정하십시오. 피펫의 위치는 조정할 수 없으므로, 피펫 팁과 필라멘트가 시야의 서로 반대편에 위치해야 합니다.

필라멘트가 가열되면서 팽창하여 피펫과 충돌할 수 있으므로, 피펫 팁을 필라멘트에 너무 가깝게 배치하지 마십시오. 팁과 필라멘트의 위치가 적절하게 잡히면 밸브를 돌려 가압 공기를 피펫으로 보내고, 팁 뒤쪽의 테이퍼 부분이 바깥쪽으로 부풀어 오르기 시작할 때까지 피펫 팁을 가열하십시오. 팁이 너무 과하게 부풀기 전에 가열을 중단하십시오.

원하는 모양을 얻기 위해 적절한 거리, 열, 시간을 결정하는 실험이 필요합니다. 선택 사항으로, 팁 개구부 직경을 줄이기 위해 압력을 가하지 않은 상태에서 팁을 연마할 수도 있습니다. 또한, 이러한 연마 단계는 정밀하게 조정하기 위해 반복될 수 있음을 유념하십시오.

피펫 팁의 모양과 치수를 모두 조정하십시오. 연마가 완료되면 압력을 차단하고 피펫 팁을 안전한 방향으로 향하게 하십시오.

피펫을 제거하여 먼지로부터 보호될 수 있는 깨끗한 보관함에 넣으십시오. 실험실의 안전을 위해 피펫을 제거하기 전에 반드시 압력을 끄십시오. 그렇지 않으면 피펫 홀더에서 피펫이 튕겨 나갈 수 있습니다.

마무리하며, 패치 클램프 기록 품질을 향상시키기 위해 피펫을 압력 연마하는 방법을 설명해 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 피펫에 기화된 금속이 증착되는 것을 최소화하기 위해 연마 코일을 고융점 유리로 코팅하는 것이 중요합니다. 또한, 피펫이 가압 공기에 노출되는 동안 주의하시기 바랍니다.

피펫이 홀더에 단단히 고정되었는지 확인하고, 홀더에서 피펫을 분리하기 전에 공기 공급을 차단하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해주셔서 감사합니다.

즐거운 압력 연마 작업 되시길 바라며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.