Name: 향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 패치-클램프 녹음용 유리 마이크로피펫을 열과 공기압으로 연마하는 방법을. 작은 세포에서 저잡음 고품질 신호 기록을 위한 필수 기술입니다.

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압력 연마 기법은 SR의 Lockery와 공동으로 개발되었습니다.

풀링 pipettes 풀러와 같은 필라멘트를 사용하면 셔터는 P - 97 / 브라운 Microelectrode의 풀러 플라밍 약 10-20 pipettes 세트를 가져옵니다. <ol><li> 당신의 유리를 선택합니다. 우리는 borosilicate을 (BF150 - 86 - 10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm)을 사용합니다. 그것이 깨끗하고 먼지가 무료로 남아 있도록 신중하게 유리를 저장합니다. </li><li> 당기는 프로그램을 디자인합니다. 기본 목표는 응용 프로그램에 따라 달라집니다 약 원하는 크기를 여는 팁입니다. 서터의 P - 97 피펫 요리책 2 훌륭한 참조입니다. </li><li> 개방 직경과 매끄러운를 결정하는 현미경 아래 pipettes을 관찰. 거친 고르지 또는 불규칙 조언을​​ 폐기하십시오. 표준 패치 클램프 녹음, 전반 2-4 μm의하는 팁 오프닝은 최고입니다. 무딘 팁은 선호하는 것과 동일한 오프닝 직경에 대한 저항을 낮은 발생합니다. 모양과 크기는 아래 연마하는 동안 수정할 수 있습니다. </li></ol> 압력 연마 pipettes <ol><li> 깨끗한 압축 공기 라인에 피펫 홀더를 연결합니다. 레귤레이터를 사용하여 ~ 40 PSI로 압축 공기 라인 압력을 설정합니다. 피펫 홀더 압력 및 해제할 수 수있는 4 방향 제어 밸브에 압축 공기 라인을 연결합니다. Tygon의 ⅛의 길이 ® 튜브와 제어 밸브에 피펫 홀더를 연결합니다. </li><li> 고압 피펫 홀더, 피트 페달, 낮은 높은 배율, 오랜 실무 거리 (이상, 10X와 100x) 공기 목표 장착된 현미경에 의해 통제 연마 코일과 연마 장비 (microforge)를 사용하십시오. 이것은 프로토콜 동안 피펫 오픈을 관찰 수 있도록 중요합니다. </li><li> 옵션 : 코트 용량을 감소하고 (이 기술에 대해 &quot;풀링 pipettes&quot;참조) 잡음 특성을 개선하기 위해 소수성 절연체로 피펫. </li><li> 압력 밸브가 OFF 위치에 있는지 확인합니다. 피펫 홀더에 피펫을 놓고 손가락으로 꽉 맞는를 조입니다. 안전주의 : 피펫이 피펫 홀더에 단단히 개최하는 경우, 공기 압력은 피펫이 피펫 홀더에서 배출되는 원인이됩니다. </li><li> microforge의 피펫과 홀더를 놓으십시오. 현미경 단계에 위치 피펫 홀더 너무 팁 및 연마 코일 모두 microforge 부족 (10X) 전원에서 볼 수있다. ~ 75 미크론 필라멘트의 끝부분을 가져와. 가열하면 필라멘트가 확장됩니다 유의하십시오. </li><li> 높은 전력 (100x) 목표로 전환합니다. 피펫 팁 및 연마 코일 모두 초점과 전망 분야에서해야합니다. 그렇지 않다면, 연마 코일의 높이를 조정합니다. (피펫의 위치를​​ 조정할 수 없습니다.) 피펫 팁 및 연마 코일 볼 분야의 반대편에 가까운해야합니다. 그것은 가열로 확장하여 피펫 뛰어들고 있기 때문에 너무 피펫 팁 가까운 코일을 위치하지 마십시오. </li><li> 피펫으로 압축 공기를 직접하기 위해 밸브를 돌려과 팁 뒤에 테이퍼가 바깥쪽을 풍선 시작 때까지 피펫 팁을 열. </li><li> 끝 너무 광범위하게 풍선 전에 가열을 중지합니다. 실험은 원하는 형태에 해당하는 거리, 열, 시간을 결정하기 위해 필요합니다. </li><li> 옵션 : 압력의 부재에있는 팁을 연마하여 팁 오프닝 직경을 절감할 수 있습니다. 단계 7과 8은 조정 피펫 팁의 형상과 크기 모두를 반복하실 수 있습니다. </li><li> 압력을 끄고 안전한 방향으로 피펫 팁을 지적하면서, 피펫을 제거하고 그것 분진으로부터 보호됩니다 깨끗한 저장 상자에 넣습니다. 안전주의 : 공기 압력이 해제되지 않은 경우, 피펫가 제거하는 동안 피펫 홀더에서 꺼낼 수 있습니다. </li></ol> microforge에 대한 참고 사항 우리는 재고품의 상용 부품의 조립 microforge을 사용합니다. (당신은 또한 몇몇 기업, 예를 들어, 에이러 과학, GlassWorx에서 압력 연마 키트를 구입할 수 있습니다.) 상관없이 microforge의 그것은 주로 직경 단지 몇 μm의입니다 팁 오프닝을 볼 승산이 충분 한가하는 광학을 가지고하는 것이 필수적입니다. 우리는이 목적을 위해 긴 작동 거리 100x 렌즈를 사용합니다. 또한, 코트 위해 높은 용해 온도 유리 연마 코일은 pipettes에서 증발 금속을 입금 최소화하기 위해. 파트 3 : 예상 결과 보통 압력 연마 직경을 열에 감지할 수있을 정도의 변화없이 피펫의 저항을 줄일 수 있습니다. 원하는 경우,이 프로토콜은 5 10MΩ 사이의 서브 마이크론 채용 및 resistances와 pipettes를 만들기 위해 사용할 수 있습니다.

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

우리는 원래 C로 2-3 μm의 뉴런에서 패치 - 클램프 녹음 pipettes 유용하게이 방법을 개발 엘레간스 1. 그것은 굿맨 실험실에서 일상 사용할 수 있습니다. 작은 C.에서뿐만 아니라, 레코딩을위한 우리 압력 폴란드어 pipettes 엘레간스의 뉴런뿐만 아니라 Xenopus oocytes의 표현 이온 채널의 macropatch 및 단일 채널 녹음을 얻는. 주어진 팁 - 오프닝 지름은 뭉툭한 형태는 낮은 저항 피펫을 생산하고 있습니다. 낮은 피펫 저항이 낮은 직렬 저항과 낮은 소음 녹음 발생합니다.

<table><tbody><tr><td>유리 모세관</td><td>소모품</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10 (또는 유사 제품)</td><td>이 방법은 석영으로 제작된 것을 제외한 모든 유형의 모세관에 적용 가능합니다. 다만, 필라멘트가 있는 모세관 사용을 권장합니다.</td></tr><tr><td>倒立 현미경</td><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL (또는 유사 제품)</td><td>일반적인 倒立 현미경이면 모두 가능합니다. 다만, 연마 중에 피펫을 확인할 수 있는 충분한 배율이 확보되어야 합니다. 이 목적으로 당사는 작동 거리가 긴 100x 금속 현미경 렌즈를 사용합니다.</td></tr><tr><td>마이크로포지 키트</td><td>도구</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>연마 코일, 컨트롤러 및 풋 페달이 제공됩니다.</td></tr><tr><td>공기압 공급원</td><td>도구</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>고압 공급을 위한 액세서리로, 적절한 밸브가 포함되어 있습니다. 또는 필터/레귤레이터(40 PSI로 설정)와 4방향 밸브(아래 참조)를 사용하여 건물의 압축 공기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>4방향 밸브</td><td>도구</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>밸브를 튜브에 연결하기 위한 피팅이 필요합니다.</td></tr><tr><td>루어 커넥터 포함 피펫 홀더</td><td>도구</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>수루어-바브(male luer-to-barb) 피팅을 사용하여 피펫 홀더를 고압 튜브에 연결하십시오.</td></tr><tr><td>Tygon&amp;#174; 튜브</td><td>도구</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>이 튜브를 사용하여 피펫 홀더를 4방향 밸브에 연결하십시오.</td></tr></tbody></table>

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 pipettes

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

압력 연마는 패치 - 클램프 녹음 유리 pipettes을 형성하는 방법이다. 우리가 먼저 작은 (&lt;3m)의 연결을 세포 기관에서 녹화에 적합한 pipettes를 fabricating이 방법을 개발했습니다. 기본 교장 유리 불어와 유사하며 일반 micropipette의 풀러 준비한 패치 pipettes의 모양을 수정하는 공기 압력과 열을 결합되어 있습니다. 이것은 소위 소프트 (소다 석회)와 하드 (borosilicate) 안경에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 압력 연마는 팁 오프닝 (굿맨과 Lockery, 2000)의 직경을 감소하지 않고 25 % 피펫 저항을 줄일 수 있습니다. 이것은 유리의 거의 모든 유형에 적용 고압 밸브와 microforge에 맞는만을 추가 요구하실 수 있습니다. 이 기술은 ultrasmall 세포 (&lt;5m)에서 녹음을 위해 필수적이며, 또한 피펫의 저항을 최소화하여 단일 채널 녹음을 향상시킬 수 있습니다. 무딘 모양이 천공 - 패치 클램프 녹음에도 유용합니다 천공에 사용할 수있는 큰 막 물집이 끝 모양 결과 때문이다.

이것은 유리 micropipettes의 모양을 수정하는 가이드입니다. 특히, 열 및 공기 압력을 사용하여 테이퍼가 낮은 피펫 저항을 선도 팁 오프닝을 증가하지 않고 확대됩니다. 이것은 작은 세포의 낮은 소음 녹음을 얻는 것이 중요합니다하지만 많은 응용 프로그램에서 유용합니다.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

압력 연마(Pressure-polishing)는 패치 클램프 기록(patch-clamp recording)용 유리 피펫을 성형하는 방법입니다. 저희는 먼저 ...에 적합한 피펫을 제작하기 위해 이 방법을 개발하였습니다.

이 절차는 100배 배율에서 피펫 팁을 폴리싱 필라멘트 근처에 위치시키는 것으로 시작합니다. 다음으로 공기압과 열을 켭니다. 필라멘트.피펫 팁이 확장되어 뭉툭한 모양의 팁이 형성됩니다. 팁의 개구부를 더 작게 만들기 위해 가열을 중단하십시오. 압력과 가열을 다시 끕니다.안녕하세요, 스탠퍼드 대학교 분자 및 세포 생리학과의 Miriam Goodman 박사 연구실 소속 Brandon Johnson입니다. 오늘은 패치 피펫을 압력 연마하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 C. elegans 뉴런의 이온 채널과 막 패치를 연구합니다.그럼 시작하겠습니다. 6개에서 10개의 패치 피펫 세트를 준비하십시오. 도움이 필요하시면 해당 분야의 전문가에게 문의하시거나, 프로그래밍 가능한 풀러를 이용한 패치 피펫 및 날카로운 전극 제작에 관한 저희의 시각화 실험 영상을 참고하시기 바랍니다.절차를 시작하려면, 압축 공기 라인의 압력을 약 40 PS.I로 설정하십시오. 그런 다음 압축 공기 라인을 4방향 제어 밸브에 연결합니다. 플라스틱 튜브를 4방향 밸브에 연결하고, 플라스틱 튜브의 빈 끝단에 고압 피펫 홀더를 부착합니다. 연마 작업을 수행하기 위해 마이크로 포지 장치를 사용하십시오.우리는 LA Scientific사의 Ccpm two 키트를 사용합니다. 이 장치는 고압 피펫 홀더, 풋 페달로 제어되는 백금 가열 필라멘트, 그리고 저배율 및 고배율 10배 및 100배의 작동 거리 공기 대물렌즈가 장착된 현미경으로 구성되어 있습니다. 프로토콜 진행 중 피펫 개구부를 관찰할 수 있는 능력이 매우 중요하므로 이러한 대물렌즈가 이상적입니다.다음으로 압력 밸브가 꺼짐(off) 위치에 있는지 확인하십시오. 그 후 피펫 홀더에 피펫을 넣고 실험실 안전을 위해 피팅을 손가락 힘으로 조여 고정하십시오. 피펫이 피펫 홀더에 단단히 고정되었는지 확인하십시오.그렇지 않으면 공기압으로 인해 피펫이 홀더에서 빠져나올 수 있습니다. 선택 사항으로, 정전 용량을 줄이고 노이즈 특성을 개선하기 위해 왁스와 같은 소수성 절연체로 피펫을 코팅할 수 있습니다. 이제 피펫 홀더를 마이크로 포지(micro forge)에 배치하고, 마이크로 포지의 10배 저배율 상태에서 팁과 연마 필라멘트가 모두 보이도록 피펫 홀더를 현미경 스테이지 위에 위치시키십시오.팁을 필라멘트에서 약 50 microns 거리까지 가져간 다음, 고배율 100 Objective로 전환하여 피펫 팁과 폴리싱 필라멘트가 모두 초점에 맞고 시야 내에 들어오도록 합니다. 만약 그렇지 않다면, 필라멘트의 높이를 조절하십시오. 피펫의 위치는 조절할 수 없으므로, 피펫 팁과 필라멘트가 시야의 서로 반대편에 위치해야 합니다.필라멘트가 가열되면서 팽창하여 피펫과 충돌할 수 있으므로, 피펫 팁을 필라멘트에 너무 가깝게 배치하지 마십시오. 팁과 필라멘트의 위치가 적절히 설정되면, 밸브를 돌려 가압 공기를 피펫으로 보내고, 팁 뒷부분의 테이퍼가 바깥쪽으로 부풀어 오르기 시작할 때까지 피펫 팁을 가열하십시오. 팁이 너무 과하게 부풀어 오르기 전에 가열을 중단하십시오.원하는 모양을 얻기 위해서는 적절한 거리, 열, 그리고 시간을 결정하기 위한 실험이 필요합니다. 선택 사항으로, 팁 개구부 직경을 줄이기 위해 압력을 가하지 않은 상태에서 팁을 연마할 수 있습니다. 또한, 이러한 연마 단계는 정밀하게 조정하기 위해 반복될 수 있음을 유의하십시오.피펫 팁의 모양과 치수를 모두 조정하십시오. 연마가 완료되면 압력을 끄고 피펫 팁을 안전한 방향으로 향하게 하십시오.피펫을 제거하여 먼지로부터 보호될 수 있는 깨끗한 보관 상자에 넣으십시오. 실험실의 안전을 위해, 피펫을 제거하기 전에 반드시 압력을 차단하십시오. 그렇지 않으면 피펫 홀더에서 피펫이 튕겨 나갈 수 있습니다.이상으로 패치 클램프 기록의 품질을 높이기 위해 피펫을 압력 연마하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 피펫에 기화된 금속이 증착되는 것을 최소화하기 위해 연마 코일에 고융점 유리를 코팅하는 것이 중요합니다. 또한, 피펫이 가압 공기에 노출되어 있을 때는 주의하시기 바랍니다.피펫이 홀더에 단단히 고정되었는지 확인하고, 홀더에서 피펫을 분리하기 전에 공기 공급을 차단하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사합니다.즐거운 압력 연마 작업이 되시길 바라며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 전기 생리학에 대한 패치 pipettes과 날카로운 전극을 만들 수있는 프로그램 풀러를 사용하는 방법을 보여줍니다. 동일한 절차는 주사 바늘을 포함한 유리 다양한 도구를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을...

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Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 수지상 멤브레인 표면에서 패치 클램프 기록 기술을 보여줍니다. 이는 도파민 뉴런에서 수상돌기와 그 아래에 있는 전위의존성 이온 채널의 전기적 특성을 직접 조사하는 데 도움이 됩니다.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Subcellular patch-clamp recordings는 수상돌기의 기능적 특성을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 이러한 미세한 구조는 직경이 작기 때문에 쉽게 접근할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 in vitro에서 도파민 뉴런의 수상돌기로부터 안정적이고 신뢰할 수 있는 기록 수집을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

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