15.5
Complementair DNA
Overzicht
Alleen genen die worden getranscribeerd in messenger RNA (mRNA) zijn actief of komen tot expressie. Wetenschappers kunnen daarom het mRNA ui…
- [Verteller] Bijna elke cel in het lichaam heeft hetzelfde DNA maar verschillende celtypes, zoals neuronen en spiercellen, uiten verschillende genen omdat alleen bepaalde genen overgebracht worden in messenger RNA of mRNA in elke cel. In het laboratorium kunnen mRNA's gebruikt worden als template om complementair DNA, cDNA, te synthetiseren om genexpressie te bestuderen. Een gangbare methode is RNA extraheren van cellen, dan het mRNA isoleren van andere soorten RNA, zoals robisomaal RNA of transfer RNA, door het sample over een kralenkolom te laten lopen waaraan strengen thymine nucleotiden bevestigd zijn.
Deze binden met de poly(A)-staart, een keten van adenine nucleotiden specifiek aanwezig aan de drie uiteindes van eukaryotisch mRNA. De andere soorten RNA binden zich niet en worden weggespoeld. Nadat het mRNA geïsoleerd is, wordt een poly(T)-primer gebonden aan de poly(A)-staart, en vormt een startpunt voor reverse-transcriptase enzymes om een enkelstrengs cDNA te translateren van het mRNA.
Stoffen zoals RNase enzymen worden dan toegevoegd om het RNA te degraderen. DNA polymerase enzymen worden dan gebruikt om een streng te synthetiseren, complementair met het cDNA wat resulteert in dubbelstrengs cDNA, dat ingevoegd kan worden in een bacteriële of virale vector en gebruikt wordt in moleculair biologie-onderzoek.
View the full transcript and gain access to JoVE Core videos
Q1: Why do scientists use complementary DNA instead of genomic DNA to study gene expression?
Complementary DNA (cDNA) lacks introns and regulatory sequences present in genomic DNA, allowing researchers to directly determine the amino acid sequence of encoded peptides. Since cDNA is synthesized from mRNA, it represents only the genes actively expressed in specific cells or tissues, making it ideal for studying gene expression patterns across different cell types.
Q2: How does the poly-A tail help isolate mRNA from other RNA types?
Mature eukaryotic mRNA has a poly-A tail—a string of adenine nucleotides—added to its 3' end, while transfer RNA and ribosomal RNA do not. Researchers attach thymine nucleotides (oligo-dTs) to a column or magnetic beads, which specifically base-pair with the poly-A tail. This allows mRNA to be captured while other RNA types are washed away.
Q3: What role does reverse transcriptase play in cDNA synthesis?
Reverse transcriptase is a DNA polymerase enzyme from retroviruses that synthesizes a single-stranded cDNA strand from mRNA. Since reverse transcriptase can only add nucleotides to the 3' end of a chain, a poly-T primer binds to the poly-A tail to provide a starting point for cDNA synthesis.
Q4: Why is the RNA degraded after the first cDNA strand is synthesized?
After reverse transcriptase creates single-stranded cDNA, the original mRNA template must be removed to allow DNA polymerase to synthesize the complementary second strand. RNA is degraded using alkali treatment or RNase enzymes, leaving the single-stranded cDNA intact for the next synthesis step.
Q5: How is double-stranded cDNA created from single-stranded cDNA?
DNA polymerase synthesizes a second DNA strand complementary to the first cDNA strand, often using the hairpin loop at the end of the first strand or a nicked piece of the mRNA as a primer. This produces double-stranded cDNA, which can be inserted into bacterial or viral vectors for molecular biology research.
Q6: What is a cDNA library and why would researchers construct one?
A cDNA library is a collection representing all the mRNAs expressed in specific cells or tissues of interest. Researchers construct cDNA libraries to comprehensively study gene expression patterns, identify active genes in particular cell types, and preserve genetic information for additional research and analysis.
Q7: How does different gene expression in neurons versus muscle cells relate to cDNA analysis?
Although neurons and muscle cells contain the same DNA, they express different genes because only certain genes are transcribed into mRNA in each cell type. By extracting and analyzing mRNA from these different cell types, researchers can use cDNA synthesis to study which genes are active and understand cell-type-specific gene expression patterns.