Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Samenvatting

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie van Xenopus laevis Eicellen met een nucleair import substraat, alsmede de voorbereiding van de geïnjecteerde eicellen voor visualisatie door dunne-snijden elektronenmicroscopie.

Samenvatting

Micro-injectie van de Xenopus laevis oöcyten gevolgd door een dunne-snijden elektronenmicroscopie (EM) is een uitstekend systeem voor het bestuderen van nucleocytoplasmic transport. Door zijn grote kern en een hoge dichtheid van de nucleaire porie complexen (NPC), kan nucleair transport gemakkelijk gevisualiseerd in het Xenopus eicel. Veel inzicht in de mechanismen van de nucleaire import en export is opgedaan door het gebruik van dit systeem (beoordeeld door Pante, 2006). Daarnaast hebben we gebruik gemaakt van micro-injectie Xenopus oöcyten om de nucleaire import paden van verschillende virussen die zich vermenigvuldigen in de gastheer kern ontleden.

Hier laten we zien de cytoplasmatische micro-injectie van Xenopus oöcyten met een nucleair import substraat. We tonen ook de voorbereiding van de geïnjecteerde eicellen voor visualisatie door dunne-snijden EM, zoals dissectie, uitdroging, en inbedding van de eicellen in een epoxy hars inbedding. Tot slot bieden wij representatieve resultaten voor eicellen die zijn gemicroinjecteerd met het capside van het baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) of het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), en bespreken mogelijke toepassingen van de techniek.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van Xenopus oöcyten voor micro-injectie

1. Leg een klein stukje (ongeveer 2 cm) van de Xenopus laevis eierstok in een 50-ml conische buis met 20 ml collagenase-oplossing (5 mg / ml collagenase in de calcium-vrije gewijzigd Barth's zout: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Collagenase wordt gebruikt om de follikel cellen die de eicellen surround te verwijderen.
2. Plaats de buis op een shaker platform en schud het (op 100 RPM) gedurende een uur. Dit keer is afhankelijk van verschillende partijen collagenase. Dus na een uur, neem dan een kleine steekproef van eicellen en bestuderen ze onder een microscoop dissectie. Goed de-folliculated eicellen moet goed worden gescheiden van elkaar, en het moet gemakkelijk zijn om een ​​glazen naald in de eicel. Als de eicellen niet voldoende de-folliculated, worden ze achtergelaten in de collagenase oplossing en gecontroleerd weer om de vijf minuten.
3. Was de eicellen drie keer met een aangepaste Barth's zoutoplossing (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0,41 mM _CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5), en over te dragen naar een 100-mm diameter Petri schaaltje met MBS plus 1% penicilline / streptomycine. De eicellen zijn nu klaar om te worden gemicroinjecteerd. Als micro-injectie zal worden uitgevoerd op een andere dag, op te slaan de eicellen bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
4. Behulp van een dissectiemicroscoop, selecteer rijpe stadium VI oöcyten voor microinjectie. Deze eicellen zijn groot, met een goed contrast tussen de zwarte dier halfrond en de crème-kleurige plantaardige halfrond.
5. Breng het volwassen stadium VI oöcyten in een microwell plaat (Nunc, 10 pi goed volume). Dit moet voorzichtig gebeuren, met behulp van een 200-ul pipet met een pipet tip die is afgesneden aan het einde ongestoord zuigkracht van de eicellen mogelijk te maken.

Deel 2: micro-injectie van Xenopus oöcyten

1. Bereid de import substraat te gemicroinjecteerd door het toevoegen van een kleine hoeveelheid van 1% broomfenolblauw, om te helpen bij het visualiseren van micro-injectie. Bijvoorbeeld, voegen we een pl broomfenolblauw tot 10 ul van de ondergrond.
2. Leg een smalle strook van Parafilm op een 100-mm diameter Petri schotel, en afzien van een 5-ul druppel van de oplossing te injecteren op de Parafilm strip.
3. Vul een eerder gekalibreerd injectienaald (verkregen door het trekken van een 6,6-il micropipet Drummond met de Inject + Matic Puller) met de oplossing te injecteren. Voor deze, is het microinjector ingesteld op aspiratie-modus. Te kalibreren de injectienaald te maken stip markeert op de naald om de 0,5 mm, wat overeenkomt met een volume van 50 nl.
4. Voor de cytoplasmatische injectie, steek de punt van de naald in een eicel in de plantaardige halfrond, zeer dicht bij het dier halfrond, op een ongeveer 45 graden. Draai de microinjector instelling microinject en microinject elke eicel met 50 nl van invoer substraat. De stip markeringen op de naald worden gebruikt om de hoeveelheid substraat die is geïnjecteerd te controleren.
5. Breng de geïnjecteerde eicellen om een ​​kleine (35-mm diameter) petrischaal gevuld met MBS, en incuberen bij kamertemperatuur voor de gewenste hoeveelheid tijd (tijdstippen zijn zo gekozen dat aan de waarneming van de import substraat geassocieerd met NPC's mogelijk te maken; dit gebeurt tussen 10 en 30 minuten voor eiwitten en voor virussen die actief worden vervoerd in de richting van de NPC, deze keer is ook afhankelijk van de plaats van injectie en de grootte van het eiwit / virus).
6. Als de incubatietijd is voltooid, transfer eicellen op een 4-ml glazen flacon met 2% glutaaraldehyde in MBS, en bevestig overnacht bij 4 ° C.

Deel 3: Dissectie van Xenopus oöcyten

1. De volgende dag, was de eicellen 3 keer met MBS.
2. Overdracht eicellen om een kleine petrischaal gevuld met een laag zout buffer (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,5). Met behulp van een dissectie microscoop en ontleden van een pincet, verwijder dan de vegetatieve pool van elke eicel. Het is nuttig om de eicel opengesneden met een pincet te stabiliseren, terwijl het andere paar wordt gebruikt als een schaar om de plantaardige paal te verwijderen. Op dit punt is het mogelijk om te beoordelen het succes van de micro-injectie door de aanwezigheid van een blauwe gloed in het cytosol. Het protocol wordt voortgezet alleen voor de eicellen die met succes waren gemicroinjecteerd. Bovendien, als de monsters worden voorbereid voor EM, deze dissectie stap maakt het veel gemakkelijker om de kern te vinden als knippen en snijden van de monsters.
3. Weer Bevestig de ontleedde eicellen met 2% glutaaraldehyde in LSB gedurende een uur bij kamertemperatuur.
4. Na fixatie, wassen ontleed eicellen drie keer met LSB.

Deel 4: Voorbereiding van Ingespoten Eicellen voor het inbedden en Thin-Sectioning EM

1. Breng de ontleed eicellen om een ​​depressie glijden. Aspireren zoveel mogelijk van de vloeistof als poslijk, en dan snel (zodat ze niet uitdrogen) dekking van de ontlede eicellen met 2% een laag smeltpunt agarose. Terwijl de agarose is nog zacht, gebruik dan een pipet tip om de eicellen van elkaar te scheiden, en ervoor te zorgen dat elke eicel wordt naar boven of naar beneden (niet zijwaarts).
2. Laat de agarose te stollen voor ongeveer 10 minuten. Nadat de agarose stolt, gebruik dan een scheermesje om de agarose in kleine stukjes gesneden, elk met een ontleed eicel.
3. Plaats de agarose-embedded eicellen in een 4-ml glazen flacon en ze post-fix met 1% Oso ₄ in LSB gedurende een uur bij kamertemperatuur.
4. Was het monster driemaal in LSB. Indien nodig, op te slaan van het monster bij 4 ° C gedurende de nacht en ga het protocol de volgende dag.
5. Opeenvolgend uitdrogen de monsters in een oplopende reeks van alcohol (50, 70, en 90% ethanol gedurende 20 min. elk). Dit wordt gevolgd door twee wijzigingen in 100% ethanol gedurende 15 min elk. Tenslotte uitdrogen monsters met 100% aceton gedurende 15 minuten.
6. Infiltreren monsters met een 1:1 mengsel van EPON (Fluka) en aceton gedurende een uur, gevolgd door infiltratie met een 2:1 mengsel van EPON en aceton gedurende twee uur, en uiteindelijk in pure Epon voor ten minste zes uur.
7. Leg monsters in flat inbedding mallen gevuld met verse pure Epon. De eicellen zijn gericht op een zodanige wijze dat de kant van de kern dichter bij de plaats van injectie - in dit geval de zijkant van de eicellen die is ontleed - wordt eerst coupes. Deze stap optimaliseert de kans op het visualiseren van invoer van het gekozen substraat.
8. Tot slot, polymeriseren de Epon gedurende twee dagen bij 60 ° C.
9. Om de monsters te visualiseren, worden de blokken gesneden en daarna in secties met behulp van een ultramicrotoom. Secties worden overgebracht op EM roosters, gekleurd met behulp van standaard procedure, en gevisualiseerd met een transmissie-elektronenmicroscoop. Wij zullen dit niet deel uitmaken van het protocol te zien zijn als het standaard EM procedure.

Deel 5: representatieve resultaten:

Als het protocol succesvol is geweest, dan is de nucleaire envelop (NE) en de NPC's moet duidelijk zichtbaar zijn in EM microfoto. Afhankelijk van de ondergrond geïnjecteerd en de hoeveelheid tijd tussen de injectie en fixatie, moet de ondergrond duidelijk zichtbaar zijn op de cytoplasmatische gezicht van de NPC, in het NPC, of ​​op de nucleaire gezicht van de NPC.

Figuur 1 toont een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is geïnjecteerd met capsiden van het baculovirus AcMNPV, geïncubeerd bij 4 ° C gedurende vier uur, en verwerkt voor het inbedden en dunne sectie EM zoals beschreven. Pijlpunten wijzen op NPCs. Een capside docking op de cytoplasmatische gezicht van een NPC wordt aangegeven door een witte pijl.

In tegenstelling tot Figuur 2 toont een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is ingespoten met het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende vier uur, en verwerkt voor het inbedden en dunne gedeelte EM zoals beschreven. Met behulp van deze techniek, hebben we ontdekt dat MVM verstoringen van de NE (Cohen en Pante, 2005) induceert. Tussen haakjes geven breuken in de NE. Pijlpunten wijzen op NPCs. Vermoedelijke MVM capsiden worden geassocieerd met het NE zijn aangegeven met witte pijlen.

Figuur 1: Electron microfoto van een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is geïnjecteerd met capsiden van het baculovirus Ac MNPV, geïncubeerd bij 4 ° C gedurende vier uur, en bewerkt voor inbedding en dun gedeelte EM zoals beschreven. Pijlpunten wijzen op NPCs. Capsiden zijn aangegeven met witte pijlen. Schaal bar: 100 nm.

Figuur 2: Electron microfoto van een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is ingespoten met het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende vier uur, en verwerkt voor het inbedden en dunne gedeelte EM zoals beschreven. Pijlpunten wijzen op NPCs. Tussen haakjes geven breuken in de NE. Vermoedelijke MVM capsiden worden geassocieerd met het NE zijn aangegeven met witte pijlen. Schaal bar: 100 nm.

Discussie

Micro-injectie van Xenopus oöcyten in combinatie met thin-coupes EM is een zeer effectief middel voor het bestuderen van nucleocytoplasmic transport. Dit systeem is gebruikt om verschillende stappen van de invoer kaart door middel van de NPC, bijvoorbeeld interactie van een nucleaire import substraat met structurele componenten van het NPC, zoals de cytoplasmatische filamenten en de nucleaire basket (beoordeeld door Pante, 2006). Het is ook gebruikt om de nucleaire import van nucleair-replicerende virussen (Pan...