Methodenartikel

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

DOI:

10.3791/1133

⸱

16 maart 2009

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure maakt gebruik van een blauw licht geactiveerd algen kanaal en cel-specifieke genetische expressie tools om synaptische potentialen op te roepen met lichtpulsen op de neuromusculaire junctie (NMJ) in Drosophila Larven. Deze techniek is een goedkoop en makkelijk te gebruiken alternatief voor zuigkracht elektrode stimulatie voor synaptische fysiologie studies in onderzoek en onderwijs laboratoria.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deel 1: Animal zorg en genetische kruisingen

  1. Onderhouden UAS-ChR2 en OK371-GAL4 fly-lijnen in aparte flessen die standaard vliegen media 8.
  2. Verzamel maagden van OK371-GAL4 vliegen lijnen en mannen van UAS-ChR2 lijnen.
  3. Zet zowel mannen en vrouwen in een flacon met standaard vliegen media gemengd met 1 mM all-trans retinal (ATR). ATR voedsel moet worden gemaakt door eerst smelten reguliere media vliegen in een magnetron voor ~ 1 minuut. Eenmaal gesmolten is, laat het voor ongeveer 30 seconden af ​​te koelen tot een minuut en daarna 100 ul van 100 mM ATR in 100% EtOH voor elke 10 ml van vliegen media toe te voegen. Plaats flacons op het ijs, vervolgens op te slaan in een donkere ruimte bij 4 ° C.
  4. Laat vliegt paren en leggen eieren in een donkere ruimte bij 22-25 ° C.
  5. Wacht 3-4 dagen tot de 3de instar larven zichtbaar zijn, op dat moment, beschikken over volwassen vliegen.

Deel 2: Rig setup

  1. Bevestig een 10x ontleden omvang oog stuk (in ons geval, van Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, NY), met blauwe LED-lichtbron met koellichaam (Thor laboratoria, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Hechten aan magnetische voet met post en klem. Bedek het koellichaam met een elektrisch geaard zijn schild om elektrische ruis gegenereerd door het licht bron te verminderen.
  2. Plaats magnetische voet met lichtbron op lucht tafel van de elektrofysiologie rig.
  3. Sluit de lichtbron circuit controle en controle circuit aansluiten op een externe spanningsbron (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
  4. Geef 1 tot 5 V pulsen om circuit controle om blauw licht te activeren.
  5. Pas de magnetische voet en de lichtbron tot blauw licht bundel is gericht op het gebied dat moet worden ingenomen door larven dissectie.

Deel 3: Dissection

  1. Plaats zes 0,1 mm insect pennen in de vloer van een Sylgard beklede schaal.
  2. Verwijder een 3 e instar larven van voedsel media en plaats in een plastic Petri-schaal.
  3. Spoel larven met een zoutoplossing om voedsel te verwijderen.
  4. Plaats larven in de buurt van de schotel ontleden getrokken pinnen en voeg zout tot ½ niveau.
  5. Plaats de larven, zodat u kunt zien twee zilveren buizen (trachea) langs dorsaal van het dier oppervlak.
  6. Rechtstreeks invoegen een grote pin in de staart tussen de tracheale buizen. Houd de larven naar beneden en plaats een tweede grote pin in zijn hoofd, en zorg ervoor dat het lichaam de lengte uitstrekken.
  7. Maak een kleine incisie in de buurt van de staart, en ga het op de lengte van het lichaam. Zorg ervoor dat de uiteinden van de schaar zo zijn opgevoed als u niet per ongeluk snijden ventrale zenuwen en / of lichaam muur spieren.
  8. Plaats vier pinnen op de vier hoeken van het dier nu open buik. Stel ze in het ontleden schotel om zo filet het dier. Pin voorbereiding van geleerd.
  9. Met behulp van tangen en scharen, verwijder het dier lef, de luchtpijp en vet lichamen.
  10. Spoel de prep met een zoutoplossing.
  11. Zoek de frontale kwabben (zoals te zien in figuur A) en ventrale ganglion van de prep.
  12. Met behulp van micro-schaar, knip voorzichtig door het ventrale ganglion net achter de frontale kwabben.

Deel 4: Muscle opname en blauw licht stimulatie

  1. Trek een 10-20 μω elektrode met behulp van een elektronische elektrode trekker (Sutter Instruments).
  2. Vul de getrokken elektrode met 3 M KCl.
  3. Plaats gevulde elektrode in elektrode houder en manoeuvreren elektrode met een micromanipulator de buurt van larvale prep onder dissectiemicroscoop op elektrofysiologie rig.
  4. Identificeer Muscle 6 (M6) in een lichaam muur segment (afb. A).
  5. Schuif elektrode in M6 en kijk voor een snelle hyperpolarisatie. Muscle rust membraan potentials moeten overal van -30 mV tot -70 mV.
  6. Stel blauw licht, zodat ontleed prep is gecentreerd in lichtbundel.
  7. Geef 20-100 ms spanningspulsen naar circuit te controleren. Stapsgewijs te verhogen voltage geleverd aan circuit te controleren. Kijk uit voor excitatoire knooppunt potentieel in de spiercel (Figuur 1B).

Representatieve resultaten:

Figuur 1A toont een schematische weergave van de opname installatie en gefileerd voorbereiding. Figuur 1B toont typische EJP opgeroepen door korte lichtpulsen. Getoond EJP amplitude is samengevat amplitude van twee motorneuronen bekend bij beide innerveren M6. Lagere lichtintensiteit ingeschakeld slechts een aandrijving (gegevens niet getoond).

figure-protocol-1

Figuur 1: A) Algemeen schema van een intracellulaire opname tuigage en met blauwe LED. Brain (Br) is verwijderd om ritmische activiteit te remmen in de ventrale ganglion (VG). ChR2 wordt uitgedrukt in de motorische neuronen met behulp van de GAL4-UAS-systeem. B) Intracellulaire opname van een M6 spier. 40 ms blauw licht pulsen (op 127 μW / mm 2) op betrouwbare wijze op te roepen grote synaptische potentialen (sterretjes) in M6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische stappen omvatten zowel de initiële dissectie en het invoeren van spiercellen. Als zenuwen zijn doorgesneden of spier is beschadigd tijdens de eerste dissectie is het moeilijk om door te gaan de rest van het experiment. Tijdens de dissectie, moet men zeer voorzichtig te ontleden schaar omhoog zoveel mogelijk hoek tijdens de dorsale incisie. Tijdens de tweede cruciale stap, het invoeren van een spiercel, moet men kijken naar een hyperpolarisatie verleden ~ 30 mV. Waarden boven de -30 mV geven aan dat de elektrod...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen RO1GM-33205 en de MH-067284 naar LC Griffith en door een Brandeis University zomer undergraduate research beurs NJ Hornstein. Voorlopige experimenten voor deze techniek werden uitgevoerd bij de Marine Biological Laboratory in het kader van de 2008 Neural Systems and Behavior zomer cursus (NIMH te verlenen: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SylgardEllsworth Adhesives4019862www.ellsworth.com
Minutens PinsFine Science Tools26002-10www.finescience.com
Dissecting DishFisher Scientificwww.fishersci.com
Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head StageA-M Systems680100www.a-msystems.com
Powerlab 4/30 data acquisition systemfigure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
Grass stimulatorGrass Technologieswww.grasstechnologies.com
Desktop ComputerDellwww.dell.com
Dissecting ScopeLeica Microsystemswww.leica-microsystems.com
Light SourceDolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Fly Media
All-Trans-RetinalSigma-Aldrich116-31-4www.sigmaaldrich.com
OK-371 Gal4 FliesBloomington Stock center
UAS-ChR2 FliesFiala lab, Griffith lab
LED controller circuitBuilt in Griffith labhttp://www.ledsupply.com
http://www.futureelectronics.com
Gecomponeerd uit:
1. 200 mA Buck Puck
2. Blauwe LED
3. Geïsoleerde draad
4. Circuit broodplank
LED Heat SinkThorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
Air TableTMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
Faraday CageBuilt in Griffith lab
Leica Leitz M Micro-ManipulatorLeica MicrosystemsACS01www.leica-microsystems.com
Electrode HolderAxon Instrumentswww.axon.com
Borosilicate GlassFHC, Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
Electrode PullerSutter Instrument Co.www.sutter.com
HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+Inhoud (mM):
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0,8
MgCl2:4 Sucrose:115
NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES
Micro-Dissection ToolsFine Science Toolswww.finescience.com

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila Neuromuscular JunctionGAL4 UAS SystemBlue Light StimulationElectrophysiology RigMuscle RecordingLarval DissectionExcitatory Junctional PotentialAll Trans Retinol

Gerelateerde artikelen