Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Samenvatting

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Samenvatting

De familie

Protocol

Deel 1: Het opzetten van de infectie

1. Groeien HeLa cellen in flesjes en wacht tot de cellen zijn ongeveer 80% confluent.
2. Bereid voldoende virale groei medium voor het experiment: regelmatig DMEM met 2% FBS en geen toegevoegde antibiotica.
3. De infectie kan worden uitgevoerd met ofwel een ruwe voorraad van vaccinia virus met een bekende titer, of sucrose gezuiverd virus met een bekende titer als u zich zorgen over de verhuurder genexpressie.
4. Als u gebruik maakt van sucrose gezuiverd virus, meteen doorlopen naar deel 2.
5. Als u gebruik maakt van een ruwe vaccinia virus voorraad, net voor de infectie, ultrasone trillingen een hoeveelheid van het virus in een beker ultrasoonapparaat met een bad van voornamelijk ijs en een beetje water.
   • Ultrasone trillingen rond de 30W gedurende 20 seconden.
   • Vortex de buis en herhaal de sonicatie 3 keer, het toevoegen van meer ijs als dat nodig is om de beker vol met ijs en gekoeld te houden.
   • Vortex tussen elke ultrasoonapparaat stap.
   • Ga verder naar deel 2.
6. Als alternatief, als je niet een kopje ultrasoonapparaat bezitten, meng een gelijk volume van de ruwe virus voorraad en 0.25mg/mL trypsine.
   • Vortex krachtig.
   • Incubeer het virus voorraad / trypsine mix in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
   • Vortex op 5-10 minuten.
   • Ga verder naar deel 2.

Deel 2: infecteren cellen

1. Bereken de hoeveelheid virale deeltjes die nodig zijn om de monolaag te infecteren op de gewenste multipliciteit van infectie (MOI). Doorgaans wordt een hoge MOI (tussen 5 en 10) die worden gebruikt voor infectie timecourses.
2. Voeg de gewenste hoeveelheid sucrose gezuiverde virus of getrypsiniseerd ruwe virus tot 37 ° C virale groei media en meng goed. U moet gebruik maken genoeg media om alleen betrekking hebben op de bodem van de kolf. Bijvoorbeeld, 10 ml van media voor een T-175 kolf.
3. Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen en spoel af met kamertemperatuur PBS.
4. Voeg de virus / virale groei media aan elke kolf.
   • Roer voorzichtig, tilt platen en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 1 uur.
   • Kantelen en swirl platen om de 15 minuten gelijkmatig verspreiden virus en houden cellen vochtig.
   • Voor een 0hr/Mock tijdstip, alleen maar de virale groei van media, met geen virus toegevoegd.
5. Na 1 uur incubatie, verwijder de media die het virus, en spoel drie keer met PBS kamertemperatuur.
6. Voeg de maximale hoeveelheid van virale groeimedium aan elke kolf. Bijvoorbeeld, 30 ml van media voor een T-175 kolf. Beginnen te tellen dit als je 0 uur tijdstip.

Deel 3: Oogsten van cellen

1. Controleer of de cellen onder een microscoop en noteer eventuele cytopathogeen effect (CPE).
2. Verwijder de media en spoel cellen met 30 ml van de ruimtetemperatuur PBS.
3. Voeg 15 ml trypsine aan de cellen en incubeer 2-5 min bij 37 ° C.
4. Controleer onder de microscoop voor mobiele onthechting en tik kolf cellen los te maken.
5. Transfer cellen met een steriele pipet serologisch in een 50 ml conische buis.
6. Was de kolf met een gelijk volume van de celgroei media, en voeg de media om de getrypsiniseerd cellen in de conische buis.
7. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Verwijder het trypsine / media uit de cel pellet.
9. Resuspendeer de celpellet in een van beide TRIzol reagens of de lysis buffer van uw gewenste RNA isolatie kit.
10. Als u gebruik maakt TRIzol, het monster te verdelen in 1 ml monsters in 1,5 ml label Eppendorf buizen en vriezen bij -80 ° C.
11. Herhaal dit voor alle tijden punten, de oogst een fles per tijdstip.

Deel 4: RNA-extractie van de monsters in TRIzol

1. Op dit punt, moet je monsters te worden gesuspendeerd in TRIzol reagens en klaar om te worden verwerkt.
2. Voeg 200μL van het BCP fasescheiding Reagens voor elke 1 ml TRIzol in elke buis. Het kan nodig zijn om het monster over te dragen aan een grotere tube als je begint met een grote hoeveelheid TRIzol.
3. Vortex of schud krachtig en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
4. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten.
5. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. De waterige fase is de heldere laag aan de bovenkant. U moet herstellen van ongeveer 600μL voor elk 1 ml van TRIzol je uit begonnen.
6. Doe een seconde fenol / chloroform extractie, dit keer met 500μL van chloroform per 1 ml TRIzol, in plaats van BCP.
7. Vortex of schud krachtig en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
8. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten.
9. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. De waterige fase is de heldere laag aan de bovenkant.
10. Voeg 20 microgram acrylamide lineaire aan elk monster. De lineaire acrylamide fungeert als een drager en helpt bij het neerslaan van de RNA.
11. Voeg 500 & micro, L van isopropanol per 1 ml TRIzol je begonnen met aan elk monster en meng goed.
12. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
13. Centrifuge in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 10-15 minuten.
14. Het RNA pellet zullen zichtbaar zijn op de bodem van de buis. Heel voorzichtig, verwijder het supernatans van de buis, hetzij met een stofzuiger aspirator, of handmatig door pipet. Niet verstoren van de pellet.
15. Was de pellet met 1 ml 70% ethanol.
    • Voeg 1 ml 70% ethanol aan de pellet.
    • Centrifugeer op topsnelheid 14.000 g gedurende 5-7 minuten.
    • Heel voorzichtig, verwijder de ethanol uit de buis, hetzij met een vacuüm aspirator, of handmatig door pipet. Controleer of de pellet zichtbaar is op de bodem van de buis.
    • Giet het supernatans af.
16. Herhaal de wasstap. Nadat het supernatans verwijderd, markeren waar pellet is op de buis.
17. Drogen aan de lucht pellet niet langer dan 5 minuten. Niet Kreukherstellend, of het RNA zal moeilijk zijn te reconstrueren!
18. Als u de optionele DNase behandeling te volgen om alle resterende DNA uit het monster, resuspendeer de pellet in 17μL van nuclease-vrij water. Anders, resuspendeer de pellet in 20μL van nuclease-vrij water en ga naar stap 22.
19. (Optioneel DNase behandeling) Met behulp van de Qiagen RNase-vrij DNase set toe te voegen 2μL Buffer RDD en 1μL gereconstitueerd RNase-vrij DNase I tot en met de geresuspendeerde RNA. Meng voorzichtig.
20. (Optioneel DNase behandeling) Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
21. (Optioneel DNase behandeling) 2μL van 2,5 mM EDTA en incubeer Voeg bij 65 ° C gedurende 5 minuten om de DNase inactiveren. Niet hoger zijn dan de inactivatie tijd of temperatuur als langere tijd / hogere temperaturen kan afbraak van het RNA oorzaak.
22. Controleer de RNA-concentratie door de spectrofotometer.
23. Bewaar het RNA-monster bij -80 ° C.
24. (Optioneel QC) Controleer de kwaliteit van RNA met behulp van een Agilent BioAnalyzer, of door het uitvoeren van het monster op een denaturerende gel en het controleren van de OD lezingen. (260nm en 260/280 ratio)

Discussie

Kritische stappen

Deel 1 & 2

Er zijn verschillende kritische stappen om het opzetten van een synchrone vaccinia infectie, waarvan de eerste voorzichtig sonicatie (of trypzinizing) van het virus, om virusdeeltjes splitsen. Vaccinia is zeer gevoelig voor het aggregeren, en de verstoring van het virus deeltjes is belangrijk voor het waarborgen van zelfs infectie van cellen. Met het oog op een synchrone infectie te bereiken, moet een hoog MOI (groter dan 2) worden geb...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
TRIzol Reagens	Reagens	Invitrogen	15596-026	Vergelijkbare reagentia, zoals TriPure van Roche, werken ook.
BCP Fase-scheidingsreagens	Reagens	Molecular Research Center	BP151
RNase-vrije DNase Set	Reagens	Qiagen	79254	DNase-behandeling is een optionele stap.