$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Om te werken onder steriele omstandigheden, is het raadzaam om alle stappen in een laminaire stroming kap uit te voeren.
1. Materialen
- HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagenase D oplossing: Collagenase D: 100 mg / ml (Collagenase D> 0,15 U / mg), in HEPES buffer
- DNase I oplossing: 20.000 U / ml DNase I
- PBS buffer bij pH 7,2
- PEB buffer: een deel BSA Stock Solution in 20 delen autoMACS spoeloplossing
- Tissue: long afgeleid van 6 / 7 weken oude volwassen vrouwelijke BALB / C muizen, vrij van aangrenzende organen.
- Optioneel: CD11c microbolletjes, MACS MS Columns, MACS Separator voor de isolatie van dendritische cellen van muizen long single-celsuspensie
2. Dissociatie het longweefsel
- Spoel weefsel in een petrischaal met PBS aan erythrocyten te verwijderen.
- Overdracht een maximum van 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C Tube met 4,9 ml HEPES buffer.
- Voeg 100 ul Collagenase D-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml Collagenase D.
- Voeg 10 uL DNase I-oplossing voor maximaal 150 mg weefsel (uiteindelijke concentratie van 40 U / ml DNase I) of 20 il DNase I voor 150 tot 450 mg longweefsel (uiteindelijke concentratie van 80 U / ml DNase I).
- Goed afsluiten van de C metro en bevestig deze op de gentleMACS Dissociator. Dan start je het programma "m_lung_01".
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met automatische rotatie of handmatig draaien om de 5 minuten.
- Keer terug naar de sample gentleMACS Dissociator en start het programma "m_lung_02".
3. Filtratie
- Bereid een 50 mL buis voor het verzamelen van cellen gefilterd door het vervangen van de kap met een 70 um mesh cel zeef.
- Zodra de tweede gentleMACS programma eindigt, afhankelijk van de verdeling van het monster materiaal in de buis, kunt u kort centrifugeer de buis om het monster materiaal op de bodem van de buis te verzamelen.
- Verwijder de cellen door het septum gesloten kap van de C-Tube met behulp van een geschikte 1000 il pipetpunt en toepassen op de cel zeef.
- Was de cel zeef met 5 ml HEPES buffer bij RT.
- Centrifugeer de cellen een pellet in een 50 ml buis 300xg gedurende 10 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in uw gewenste volume van de PEB buffer.
Deel 4: representatieve resultaten:
Figuur 1. Lung dissociatie met de gentleMACS ™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechts dot plot, links dot plot: geen PI kleuring).
Figuur 2. Dissociatie van de muis longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage van de levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De afgeleide single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en de CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd door flowcytometrie.
Figuur 3. Single-celsuspensie afgeleid van muizen longweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC voor muis CD11c laag m-PDCA-1 + plasmacytoïde DCs evenals CD11c hoge cellen te detecteren.
Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c microbolletjes, een MiniMACS Separator en twee MS kolommen.