Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De voorbereiding van single-cell schorsingen van weefsel is een belangrijke voorwaarde voor veel experimenten in cellulair onderzoek. Het proces van dissociëren hele organen vereist specifieke parameters om een groot aantal levensvatbare cellen te verkrijgen op een reproduceerbare manier. De gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. Het instrument bevat voorgeprogrammeerde instellingen die zijn geoptimaliseerd voor het efficiënt, maar zachte dissociatie van een verscheidenheid van weefsels types, inclusief muis longen. In deze publicatie het gebruik van de gentleMACS Dissociator op longweefsel zijn afgeleid van muizen is aangetoond.
Protocol
Om te werken onder steriele omstandigheden, is het raadzaam om alle stappen in een laminaire stroming kap uit te voeren.
1. Materialen
- HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagenase D oplossing: Collagenase D: 100 mg / ml (Collagenase D> 0,15 U / mg), in HEPES buffer
- DNase I oplossing: 20.000 U / ml DNase I
- PBS buffer bij pH 7,2
- PEB buffer: een deel BSA Stock Solution in 20 delen autoMACS spoeloplossing
- Tissue: long afgeleid van 6 / 7 weken oude volwassen vrouwelijke BALB / C muizen, vrij van aangrenzende organen.
- Optioneel: CD11c microbolletjes, MACS MS Columns, MACS Separator voor de isolatie van dendritische cellen van muizen long single-celsuspensie
2. Dissociatie het longweefsel
- Spoel weefsel in een petrischaal met PBS aan erythrocyten te verwijderen.
- Overdracht een maximum van 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C Tube met 4,9 ml HEPES buffer.
- Voeg 100 ul Collagenase D-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml Collagenase D.
- Voeg 10 uL DNase I-oplossing voor maximaal 150 mg weefsel (uiteindelijke concentratie van 40 U / ml DNase I) of 20 il DNase I voor 150 tot 450 mg longweefsel (uiteindelijke concentratie van 80 U / ml DNase I).
- Goed afsluiten van de C metro en bevestig deze op de gentleMACS Dissociator. Dan start je het programma "m_lung_01".
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met automatische rotatie of handmatig draaien om de 5 minuten.
- Keer terug naar de sample gentleMACS Dissociator en start het programma "m_lung_02".
3. Filtratie
- Bereid een 50 mL buis voor het verzamelen van cellen gefilterd door het vervangen van de kap met een 70 um mesh cel zeef.
- Zodra de tweede gentleMACS programma eindigt, afhankelijk van de verdeling van het monster materiaal in de buis, kunt u kort centrifugeer de buis om het monster materiaal op de bodem van de buis te verzamelen.
- Verwijder de cellen door het septum gesloten kap van de C-Tube met behulp van een geschikte 1000 il pipetpunt en toepassen op de cel zeef.
- Was de cel zeef met 5 ml HEPES buffer bij RT.
- Centrifugeer de cellen een pellet in een 50 ml buis 300xg gedurende 10 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in uw gewenste volume van de PEB buffer.
Deel 4: representatieve resultaten:
Figuur 1. Lung dissociatie met de gentleMACS ™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechts dot plot, links dot plot: geen PI kleuring).
Figuur 2. Dissociatie van de muis longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage van de levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De afgeleide single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en de CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd door flowcytometrie.
Figuur 3. Single-celsuspensie afgeleid van muizen longweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC voor muis CD11c laag m-PDCA-1 + plasmacytoïde DCs evenals CD11c hoge cellen te detecteren.
Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c microbolletjes, een MiniMACS Separator en twee MS kolommen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze video, introduceren we een nieuwe methode voor de dissociatie van de muis longweefsel. We laten zien dat een combinatie van mechanische en enzymatische behandeling van het longweefsel een hoog percentage van levensvatbare leukocyten en endotheelcellen opgeleverd. In het bijzonder, was de mechanische desintegratie van het weefsel bereikt door de gentleMACS Dissociator. De gentleMACS C Tubes zijn een rotor - stator systeem, dat scheidt weefsel in een zachte manier. De procedure wordt gecontroleerd door de programm...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs zijn werknemers van Miltenyi Biotec GmbH, de fabrikant van het instrument dat in dit artikel wordt gebruikt.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn medewerkers van Miltenyi Biotec GmbH, Duitsland.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C-buizen | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx |
| gentleMACS™ Startset | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| MACSmix™ Buisrotator | Miltenyi Biotec | Bestelnr. 130-090-753 | 0,15 U/mg), in HEPES-buffer DNase I-oplossing: 20.000 U/mL DNase I PBS-buffer bij pH 7,2 PEB-buffer: 1 deel BSA-stockoplossing in 20 delen autoMACS Rinsing Solution Weefsel: long afkomstig van een volwassen vrouwelijke BALB/C-muis van 6 tot 7 weken oud, vrij van aangrenzende organen. Optioneel: CD11c MicroBeads, MACS MS-kolommen, MACS Separator voor de isolatie van dendritische cellen uit een enkelcellupsuspensie van muizenlong. 2. Dissociëren van het longweefsel Spoel het weefsel in een petrischaal met PBS om erytrocyten te verwijderen. Overbreng maximaal 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C-buis met 4,9 mL HEPES-buffer. Voeg 100 μL Collagenase D-oplossing toe tot een eindconcentratie van 2 mg/ml Collagenase D. Voeg 10 μL DNase I-oplossing toe voor maximaal 150 mg weefsel (eindconcentratie van 40 U/ml DNase I) of 20 μL DNase I voor 150-450 mg longweefsel (eindconcentratie van 80 U/mL DNase I). Sluit de C-buis stevig en bevestig deze op de gentleMACS Dissociator. Voer vervolgens het programma "m_lung_01" uit. Incubeer gedurende 30 min bij 37°C met automatische rotatie of door elke 5 min handmatig te draaien. Plaats de monsterbuis terug in de gentleMACS Dissociator en voer het programma "m_lung_02" uit. 3. Filtratie Bereid een 50 mL buis voor het opvangen van gefilterde cellen door de dop te vervangen door een cellstrainer met een maaswijdte van 70 μm. Zodra het tweede gentleMACS-programma is beëindigd, kunt u de buis kort centrifugeren om het monstermateriaal onderin de buis te verzamelen, afhankelijk van de verdeling van het monstermateriaal in de buis. Verwijder de cellen via de met een septum afgedichte dop van de C-buis met een geschikte 1000 μl pipetpunt en breng ze aan op de cellstrainer. Was de cellstrainer met 5 ml HEPES-buffer bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen tot een pellet in een 50 mL buis bij 300xg gedurende 10 min. Sifon het supernatant af en resuspendeer de celpellet in het gewenste volume PEB-buffer. Deel 4: Representatieve resultaten: Figuur 1. Longdissociatie met de gentleMACS™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechter dotplot; linker dotplot: geen PI-kleuring). Figuur 2. Dissociatie van muizenlongweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De verkregen enkelcellussuspensies werden gekleurd met CD45-PE en CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd via flowcytometrie. Figuur 3. De enkelcellussuspensie afgeleid van muizenlongweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC om muizen CD11clow m-PDCA-1+ plasmacytoïde DC's alsook CD11chigh cellen te detecteren. Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c MicroBeads, een MiniMACS Separator en twee MS-kolommen."http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| autoMACS™ Spoeloplossing | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-091-222 | 0,15 U/mg), in HEPES-buffer DNase I-oplossing: 20.000 U/mL DNase I PBS-buffer bij pH 7,2 PEB-buffer: 1 deel BSA-stockoplossing in 20 delen autoMACS Rinsing Solution Weefsel: long afkomstig van een volwassen vrouwelijke BALB/C-muis van 6/7 weken oud, vrij van aangrenzende organen. Optioneel: CD11c MicroBeads, MACS MS-kolommen, MACS-separator voor de isolatie van dendritische cellen uit een enkelcel-suspensie van muizenlong. 2. Dissociëren van het longweefsel Spoel het weefsel in een Petrischaal met PBS om erytrocyten te verwijderen. Overbreng maximaal 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C Tube met 4,9 mL HEPES-buffer. Voeg 100 μL Collagenase D-oplossing toe tot een eindconcentratie van 2 mg/ml Collagenase D. Voeg 10 μL DNase I-oplossing toe voor maximaal 150 mg weefsel (eindconcentratie van 40 U/ml DNase I) of 20 μL DNase I voor 150-450 mg longweefsel (eindconcentratie van 80 U/mL DNase I). Sluit de C Tube stevig en bevestig deze aan de gentleMACS Dissociator. Start vervolgens het programma "m_lung_01". Incubeer 30 min lang bij 37°C met automatische rotatie of door elke 5 min handmatig te draaien. Plaats de monster opnieuw in de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_lung_02". 3. Filtratie Bereid een 50 mL buis voor het opvangen van gefilterde cellen door de dop te vervangen door een cellstrainer met een maaswijdte van 70 μm. Zodra het tweede gentleMACS-programma is beëindigd, kunt u de buis kort centrifugeren om het monstermateriaal onderin de buis te verzamelen, afhankelijk van de verdeling van het monstermateriaal in de buis. Verwijder de cellen via de septumafdichting van de dop van de C Tube met een geschikte 1000 μl pipetpunt en breng ze aan op de cellstrainer. Was de cellstrainer met 5 ml HEPES-buffer bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen tot een pellet in een 50 mL buis bij 300xg gedurende 10 min. Aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in het gewenste volume PEB-buffer. Deel 4: Representatieve resultaten: Figuur 1. Longdissociatie met de gentleMACS™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechter dot plot; linker dot plot: geen PI-kleuring). Figuur 2. Dissociatie van muizenlongweefsel met de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De verkregen enkelcel-suspensies werden gekleurd met CD45-PE en CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd via flowcytometrie. Figuur 3. Enkelcel-suspensie afgeleid van muizenlongweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC om muizen CD11clow m-PDCA-1+ plasmacytoïde DC's alsmede CD11chigh cellen te detecteren. Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c MicroBeads, een MiniMACS-separator en twee MS-kolommen."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx |
| MACS® BSA-stockoplossing | Miltenyi Biotec | Bestelnr. 130-091-376 | http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx |
| CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | Bestelnr. 130-052-001 | http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx |
| CD11c-FITC, CD11c-PE | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-092-026130-091-830 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx |
| Anti-mPDCA-1-APC | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-091-963 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx |
| CD146-FITC | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-092-026 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx |
| CD45-PE | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-091-610 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx |
| Propidiumjodide-oplossing | Miltenyi Biotec | Bestelnummer 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/nl/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
| Art 1000 Reach Pipetpunten | Molecular BioProducts | Bestelnummer 2079 | http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61 0,15 U/mg), in HEPES-buffer DNase I-oplossing: 20.000 U/ml DNase I PBS-buffer bij pH 7,2 PEB-buffer: 1 deel BSA-stockoplossing in 20 delen autoMACS Rinsing Solution Weefsel: long afkomstig van een volwassen vrouwelijke BALB/C-muis van 6/7 weken oud, vrij van aangrenzende organen. Optioneel: CD11c MicroBeads, MACS MS Columns, MACS Separator voor de isolatie van dendritische cellen uit een single-cell suspensie van muizenlong. 2. Dissociëren van het longweefsel Spoel het weefsel in een petrischaal met PBS om erytrocyten te verwijderen. Overbreng maximaal 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C Tube met 4,9 ml HEPES-buffer. Voeg 100 μl Collagenase D-oplossing toe tot een eindconcentratie van 2 mg/ml Collagenase D. Voeg 10 μl DNase I-oplossing toe voor maximaal 150 mg weefsel (eindconcentratie 40 U/ml DNase I) of 20 μl DNase I voor 150-450 mg longweefsel (eindconcentratie 80 U/ml DNase I). Sluit de C Tube stevig en bevestig deze op de gentleMACS Dissociator. Voer vervolgens het programma "m_lung_01" uit. Incubeer 30 min bij 37°C met automatische rotatie of door elke 5 min handmatig te draaien. Plaats de sample terug in de gentleMACS Dissociator en voer het programma "m_lung_02" uit. 3. Filtratie Bereid een 50 ml buis voor het opvangen van gefilterde cellen door de dop te vervangen door een cellstrainer met een 70 μm mesh. Zodra het tweede gentleMACS-programma is beëindigd, kunt u de buis, afhankelijk van de verdeling van het sampelmateriaal in de buis, kort centrifugeren om het sampelmateriaal onderin de buis te verzamelen. Verwijder de cellen via de septumafdichting van de dop van de C Tube met een geschikte 1000 μl pipetpunt en breng deze aan op de cellstrainer. Was de cellstrainer met 5 ml HEPES-buffer bij RT. Centrifugeer de cellen tot een pellet in een 50 ml buis bij 300xg gedurende 10 min. Aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in het gewenste volume PEB-buffer. Deel 4: Representatieve resultaten: Figuur 1. Longdissociatie met de gentleMACS™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechter dot plot; linker dot plot: geen PI-kleuring). Figuur 2. Dissociatie van muizenlongweefsel met de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De verkregen single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd via flowcytometrie. Figuur 3. De single-cell suspensie afgeleid van muizenlongweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC om muis CD11clow m-PDCA-1+ plasmacytoïde DC's cũng als CD11chigh-cellen te detecteren. Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c MicroBeads, een MiniMACS Separator en twee MS Columns.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html |
Referenties
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
