Beschrijven we een In vivo Fluorescentie beeldvorming protocol om regeneratie van de spieren te controleren door GFP-gelabelde myoblasten na de transplantatie in de skeletspieren bij zowel gezonde en dystrofische muizen. Dit protocol kan worden aangepast aan de regeneratie van de spieren studie van transplantatie van andere typen cellen en in andere gespierd omstandigheden ook.
Methodenartikel
Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Spierdystrofieën zijn een groep van degeneratieve spierziekten gekenmerkt door een progressief verlies van contractiele spiercellen. Op dit moment is er geen genezende behandeling beschikbaar is. Recente ontwikkelingen in stamcelbiologie hebben nieuwe hoop voor de ontwikkeling van effectieve cell-based therapieën voor deze ziekten te behandelen. Transplantatie van verschillende soorten stamcellen gelabeld met fluorescerende eiwitten in de spieren van dystrofische diermodellen is in grote lijnen in het veld gebruikt. Een niet-invasieve techniek met de mogelijkheid om het getransplanteerde lot van de cel spoor lengterichting verder kunnen ons vermogen om de spieren innesteling te evalueren door getransplanteerde cellen meer nauwkeurig en efficiënt.
In de huidige studie hebben we laten zien dat in vivo fluorescentie beeldvorming is een gevoelige en betrouwbare methode voor het bijhouden van getransplanteerde GFP (Green Fluorescent Protein)-gelabelde cellen in de muis skeletspieren. Ondanks de bezorgdheid over de achtergrond te wijten aan het gebruik van een extern licht nodig voor excitatie van fluorescerend eiwit, vonden we dat met behulp van hetzij naakt muis of het elimineren van haar met ontharing reagentia veel van dit probleem wordt geëlimineerd. Met behulp van een CCD camera, kan het fluorescerende signaal worden gedetecteerd in de tibialis anterior (TA) spier na injectie van 5 x 10 5 cellen van zowel GFP transgene muizen of eGFP getransduceerde myoblast cultuur. Voor meer oppervlakkige spieren, zoals de extensor digitorum longus (EDL), injectie van minder cellen produceert een detecteerbaar signaal. Intensiteit van het signaal kan worden gemeten en gekwantificeerd als het aantal uitgezonden fotonen per seconde in een regio van belang (ROI). Omdat de verkregen beelden tonen duidelijke grenzen afbakenen van het gebied geënt, kan de grootte van de ROI ook worden gemeten. Als de benen worden steeds geplaatst elke keer, de veranderingen in het totale aantal fotonen per seconde per spier en de grootte van de ROI weerspiegelen de veranderingen in het aantal geënt cellen en de grootte van het geënte gebied. Daarom zijn de veranderingen in dezelfde spier na verloop van tijd zijn kwantificeerbaar. In vivo fluorescentie beeldvormende techniek is voornamelijk gebruikt om de groei van cellen tumorogenic spoor, onze studie toont aan dat het een krachtig instrument dat ons in staat stelt om bij te houden over het lot van de getransplanteerde stamcellen.
Protocol
Celpreparaat
- Satelliet celisolatie
- Onder narcose zijn de spieren van de ledematen GFP transgene muizen (C57BL / Ka-βactin-EGFP) verwijderd. Na het snijden in kleine stukjes, satelliet-cellen zijn enzymatisch gedissocieerd door het incuberen van het gehakt weefsel met 2% dispase collagenase-oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Neutraliseer het enzym digestie met de groei media met Ham F-10 en 20% FBS, dissociëren de spier door herhaalde fijnwrijven met een Pasteur pipet. De cellen worden gefilterd door een zeef cel (Ø70-100 urn) en daarna uitgeplaat op een niet-gecoate schaal gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en de plaat ze op een collageen gecoate schaal. Later herhaalt u deze stap 1 uur om de myoblasten te zuiveren. (Pre-plaat)
- Wijzig de media en het bord van de cellen in de tijd. De laatste gezuiverde myoblasten worden gekweekt in medium met Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (groeimedium) bij 37 ° C met 5% CO2, 95% lucht.
- Cultuur en uitbreiding van de primaire myoblasten in groeimedium met toevoeging van de fundamentele FGF van 10 ng / ml.
- Voor alle in vivo experimenten, we injecteren 5x10 5 cellen per TA spier.
- Bij het oogsten van de myoblasten, we los van de cellen met behulp van 0,25% trypsine / EDTA en wassen met PBS twee keer. De cel aantallen worden geteld met een hemocytometer en de cellen worden geresuspendeerd in HBSS met een concentratie van 5x10 4 cellen / ul. De geconcentreerde cellen in HBSS worden geplaatst op ijs en geïnjecteerd binnen 1 uur na de inzameling.
In vivo beeldvorming
- Man mdx muizen op de leeftijd van 4-6 weken worden ingekocht bij Jackson laboratorium en gehandhaafd op een huisvesting van dieren faciliteit.
- Na ongeveer een week van de accommodatie voor het milieu, de muizen zijn klaar om te worden geïmplanteerd met de gekweekte cellen.
- Voor celtransplantatie, de muis wordt verdoofd door een intraperitoneale (ip) injectie van het mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Vervolgens het haar rond de TA spier gebied wordt verwijderd door het toepassen van Nair om het been en wacht 30 seconden te vegen het schoon met gedestilleerd water.
- Terwijl de muis is nog steeds onder verdoving, zijn 5x10 5 cellen in 10μl HBSS langzaam geïnjecteerd in elk TA spier op 3 punten met behulp van een naald van 30 gauge.
- Na stap 4, kan de muis regelmatig worden afgebeeld door de in vivo fluorescentie beeldvorming. De fluorescentie imaging station Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc), uitgerust met een zeer gevoelige CCD-camera, wordt gebruikt om beelden te verkrijgen van de hinderen benen van de muizen.
- Op de dag van in vivo beeldvorming, hebben we eerst de haargroei op de TA spier. Indien nodig, we opnieuw toe te passen Nair om het haar te verwijderen zoals hierboven beschreven, na verlamming van de muis met het mengsel van ketamine en xylazine.
- Terwijl de muis wordt onder narcose, plaatsen we de muis in een buikligging op een stuk zwart non-fluorescerend papier (zwart Artagain papier uit Strathmore). Om volledig de TA spier bloot te leggen voor een betere beeldvorming, we tape de achterpoten op het papier.
- Plaatsen we de muis in de imaging-kamer en de positie van de achterbeen af te beelden in het centrum van gezichtsveld van de camera. We hebben eerst naar de emissie-filter om een traditionele grijs-schaal fotografisch beeld van het been met een belichtingstijd van 5 seconden duren. Stel de positie van de muis en de focus van de camera als dat nodig is. De imaging parameters inclusief belichtingstijd (1250 ms), monster hoogte (0,9 cm), enz., worden constant gehouden in de experimentele proces.
- Vervolgens hebben we schakelaar in de juiste emissie-filter voor de groen fluorescerend eiwit golflengte. We nemen fluorescentie beeld met een belichtingstijd van 1250 ms en een binning aantal van 1. Na de beeldvorming, is de muis uit de beeldvorming kamer naar een kooi om het herstel te wachten.
- Voor analyse, trekken we een region of interest (ROI) over de fluorescente signalen naar hun intensiteit te meten in termen van fotonen per seconde. We meten ook de grootte van de ROI in termen van aantal pixels als een andere kwantificering waarde. De imaging experimenten kunnen worden herhaald om de week of vaker over een paar maanden, indien nodig, longitudinale gegevens te verkrijgen.
Aan het einde van de experimenten, wordt de muis gedood en de TA spier wordt geoogst voor histologie analyse.
Discussie
We zetten een betrouwbare en stabiele imaging platform voor het bijhouden van de fluorescentie gelabelde getransplanteerde cellen in het gastland skeletspieren in deze studie. GFP-gelabelde myoblasten van GFP transgene muis staat voor een soort van volwassen stamcellen die zullen worden kandidaten voor celtherapie in de toekomst. Een constante manipulatie zoals mobiele nummer, cel-injectie, heldere achtergrond, imaging positie en de machine parameter is van belang voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit beeld en in het bijzonder voor de kwantitatieve analyse.
Fluorescentie beeldvorming heeft veel toepassingen in biomedisch onderzoek zoals het is non-invasief, eenvoudig te gebruiken, en heeft een hoge throughput. Daarnaast fluorescentie beeldvorming kan een kwantitatieve meting op basis van de foton telt, hoewel te wijten aan de verstrooiing, demping en absorptie, kan het licht niet door een grote afstand in het weefsel, dat is een tekortkoming van de techniek. Er zijn inspanningen gedaan om rood of nabij-infrarood reporter te gebruiken om de indringdiepte van het licht te verhogen.
Een ander voordeel van fluorescentie beeldvorming is dat het vertaalbaar naar klinieken als de specifieke tl-reporter is goedgekeurd voor menselijk gebruik. In vergelijking met MRI, CT en PET, fluorescentie beeldvorming heeft een hoge flexibiliteit als het niet nodig dure hardware en imaging agenten. Een voorbeeld hiervan is het fluorescentie-based endoscoop en micro-endoscoop die zijn gebruikt in klinieken. Door het combineren van fluorescentie beeldvorming met andere modaliteiten, verwachten we de mogelijkheid om zowel de anatomische en functionele informatie over de onderliggende biologische processen te verwerven bereiken.
Dankbetuigingen
Het werk van Z en Y Yang Wang werd mede mogelijk gemaakt door subsidie van K02 AR051181 NIAMS / NIH, subsidies aan spierdystrofie Vereniging en Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Het werk van Q en X Zeng Xu worden ondersteund door een programma subsidie toegekend aan de Optical Imaging Lab van het Brigham and Women's Hospital. De auteurs willen graag Wen Liu bedanken van de afdeling Anesthesie, BWH, voor technische hulp in cel te werken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
Referenties
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
Herprints en machtigingen
