Dit is een methode voor het genereren van gynogenetische diploïde zebravissenembryo's (embryo's waarvan de enige genetische bijdrage van de moeder afkomstig is) door de tweede meiotische deling onmiddellijk na bevruchting met ultraviolet-geïnactiveerde sperma te blokkeren. EP-embryo's zijn niet volledig homozygoot vanwege recombinatie tijdens de eerste meiotische deling, maar ze zijn wel homozygoot op alle loci die niet door recombinatie van hun centromeer zijn gescheiden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het maken van Gynogenetic Diploïde zebravis in het begin van Pressure
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Heterozygotie bij diploïde eukaryoten maakt genetische onderzoeken vaak omslachtig. Methoden die levensvatbare homozygote diploïde nakomelingen voortbrengen uit heterozygote vrouwtjes, maken het mogelijk om gemuteerde F1-vrouwtjes direct te screenen op schadelijke mutaties in een versneld forward-genetisch onderzoek. Streisinger et al.1,2beschreef methoden voor het maken van gynogenetische (homozygote) diploïde zebrafish doordat zebrafish-eicellen worden geactiveerd met door ultraviolet licht geïnactiveerde zaadcellen en door fysische behandelingen (hitte of druk) die microtubuli despolimeriseren, wordt ofwel de tweede meiotische of de eerste zygotische celdeling voorkomen. De methode van "vroege druk" (EP) blokkeert de meiose II, die kort na de bevruchting plaatsvindt. De EP-methode levert een hoog percentage levensvatbare embryo's op die zich kunnen ontwikkelen tot vruchtbare volwassenen van beide geslachten. De methode genereert embryo's die homozygoot zijn op alle loci, behalve op die loci die tijdens meiose I door recombinatie van hun centromeer zijn gescheiden. Homozygote mutaties worden in EP-worpen gedetecteerd tussen 50% voor centromerische loci en minder dan 1% voor telomerische loci. Deze methode is letterlijk overgenomen uit het Zebrafish Book3.
Protocol
Overzicht van vroege druk
Opmerking: recepten voor veel van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zoals tricaine, viswater en Hanks-zoutoplossing, zijn online beschikbaar in hoofdstuk 10 van het Zebrafish Book3 (http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)
- Produceer embryo's door middel van in vitro fertilisatie met behulp van UV-geïnactiveerde sperma.
- Breng de bevruchte eieren onmiddellijk over naar een glazen flacon (met een plastic klikdop) die tot de rand is gevuld met eiwater. Bedek het open uiteinde van de flacon met een dun vel latexrubber en klik de dop (waarin een gat is gemaakt) over het rubber op de flacon.
- Plaats de flacon in een hydraulische pers en verhoog 1,4 min na de bevruchting de druk naar 8.000 p.s.i. (Let op dat veel persen zijn gekalibreerd om de druk te lezen die wordt uitgeoefend op een zuiger met een diameter van 2 inch, en dat de aflezingen moeten worden omgezet naar p.s.i.)
- Begin 6 min na de bevruchting met het geleidelijk verlagen van de druk over een periode van 1 min.
Gedetailleerde procedure voor vroege drukmeting
- Dag voor het experiment
- Scheid in de late namiddag de mannetjes en vrouwtjes die zullen worden gestript. Elk oud mannetje kan worden gebruikt, aangezien hij geen genetisch materiaal zal bijdragen. Vrouwtjes moeten er groot uitzien met een dikke buik. Mannetjes moeten geel en vitaal ogen.
- Houd vrouwtjes en mannetjes 's nachts gescheiden in opvangbakken waar ze in de ochtend gemakkelijk toegankelijk zijn.
- Ochtend van het experiment
- Bereid Hanks-oplossing voor; voeg natriumbicarbonaat toe.
- Neem mee naar de visfaciliteit: ijsemmer, Hanks, Tricaine, timer, buisjes voor het verzamelen van sperma.
- Verdun Tricaine in viswater.
- Verzamelen van sperma
- Bereid een helder flesje met Hanks-oplossing op ijs voor. Meet ~50 μl per mannetje dat gestript zal worden.
- Anestheseer 3 of 4 mannetjes tegelijk door onderdompeling in tricaine. Ze kunnen met een plastic lepel uit het anestheticum worden getild.
- Spoel af in viswater en dep "vochtig-droog" met een papieren handdoek (zeer belangrijk: water activeert het sperma).
- Plaats de vis in een schuimhouder onder een stereomicroscoop bij lage vergroting met epi-verlichting. Scheid de buikvinnen met een pincet en positioneer een microcapillair bij de opening van de cloaca.
- Strijk zachtjes maar stevig langs de zijkanten van de vis met een gladde (Millipore) pincet.
- Zodra het melkachtige sperma uit de genitale porie komt, verzamel je dit in het microcapillair met behulp van zachte zuiging.
- Pool het sperma van meerdere mannetjes in ijskoude Hanks-zoutoplossing. Sperma van 5-10 mannetjes is voldoende voor de bevruchting van enkele honderden eitjes. Sperma in koude Hanks-oplossing blijft gedurende enkele uren of zelfs dagen efficiënt eitjes bevruchten. Schat de spermaconcentratie visueel in en verzamel voldoende om een troebele suspensie te maken.
- UV-inactivering van sperma
- Vul de bodem van een glazen Petrischaal met ijs.
- Plaats een horlogeglas bovenop het ijs in de schaal.
- Breng met een Pasteurpipet het sperma vanuit de reageerbuis over naar het horlogeglas. Zorg dat er zoveel mogelijk sperma in de pipet komt zonder luchtbellen mee te nemen. Blaas het sperma bovendien niet op in het horlogeglas terwijl je het uit de pipet spuit. Spuit het sperma in een dunne, gelijkmatige laag op het horlogeglas. GOOI DEZE PIPET WEG.
- Plaats de Petrischaal in een UV-crosslinker.
- Zet de crosslinker 2 minuten aan.
- Verwijder het sperma met een SCHONE pipet van het horlogeglas en breng het over naar een eppendorfflesje gemarkeerd met UV Sperm en plaats dit op ijs.
- Eierverzameling en in vitro bevruchting
- Anestheseer drie of vier vrouwtjes tegelijk in tricaine.
- Spoel af in viswater en dep "vochtig-droog" met een papieren handdoek. Te veel water zal de eitjes doen opzwellen en de bevruchting belemmeren.
- Plaats het vrouwtje in een plastic petrischaal van 35 mm en druk met vochtige (niet natte) vingers zachtjes maar stevig op de buik. Als ze klaar is om eitjes te leggen, zullen deze vrij gemakkelijk naar buiten komen.
- Verzamel de eitjes met een spatel en breng het vrouwtje terug in het water. Goede eitjes hebben een gelige, doorschijnende kleur, terwijl eitjes die te lang in het vrouwtje zijn gebleven wit en waterig zijn (zie hieronder). Om goede eitjes te verkrijgen, verzamel je deze gedurende de eerste 2 uur nadat het licht in de visfaciliteit is aangegaan. Houd de eitjes afgedekt om uitdroging te voorkomen.
- Voeg 30-50 μl van de UV-spermasuspensie toe aan de eitjes en roer voorzichtig met de pipetpunt.
- Voeg onmiddellijk ongeveer 1 ml viswater toe en start de timer. Eitjes die op dit punt worden nagelaten te ontwikkelen, zullen haploïde zijn.
- Vroege druk. Let op: stappen a-g moeten binnen 90 seconden na bevruchting worden voltooid!
- Start de timer op het moment dat de eitjes worden geactiveerd door de toevoeging van water.
- Wacht een paar momenten en voeg meer water toe; draai de eitjes naar het midden van de schaal.
- Breng de bevruchte eitjes met een afgeknipte en gepolijste Pasteurpipet over naar de drukflesjes.
- Voeg indien nodig meer eierwater toe aan de flesjes zodat ze bijna overstromen, waarbij een druppel water op de rand van de flesjes blijft staan.
- Plaats een rubberen dop over de waterdruppel en bevestig het plastic deksel over het rubber.
- Plaats het flesje (of de flesjes) ondersteboven in de drukcilinder en voeg meer eierwater toe om de cilinder te vullen. Sluit de dop van de cilinder stevig.
- Plaats de cilinder in de pers met de zuiger omhoog en breng een druk van 8,000 lbs/sq. in toe.
- Laat de cilinder in de pers tot 6 min na het tijdstip van activatie (voor een totale druktijd van 4,5 min).
- Verwijder na 6 min na activatie de cilinder uit de pers en haal de flesjes uit de cilinder. Droog de flesjes voorzichtig af om afkoeling van de embryo's te voorkomen.
- Reset de cilinder en vul deze opnieuw met eierwater.
- Bereid de volgende flesjes voor door ze indien nodig gedeeltelijk te vullen met eierwater.
- Herhaal dit voor alle batches eitjes.
OPMERKING: De cilinder kan tot 3 vials tegelijk bevatten, dus het kan raadzaam zijn om de bevruchting van de eitjes enkele minuten uit te stellen om te zien of andere vrouwtjes die al in het tricaine zitten eitjes afgeven. Dit helpt het proces te versnellen door meer batches tegelijkertijd te behandelen. Onthoud daarnaast dat er geen extra vissen in het tricaine geplaatst mogen worden zodra de pers in gebruik is, totdat de behandeling is voltooid. Te lang in het anestheticum blijven kan fataal zijn voor de vissen. Ten tweede kunnen eitjes die verkregen worden door vissen uit te knijpen terwijl de pers in gebruik is, te droog zijn om nog levensvatbaar te zijn tegen de tijd dat de pers opnieuw gebruikt kan worden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat embryo's die met deze methode zijn geproduceerd, echte gynogenetische diploïden zijn. Genereer als controles een nest normale diploïde eieren (door een deel van het sperma zonder UV-inactivering apart te houden) en een nest haploïde embryo's (door een nest eieren die zijn bevrucht met UV-sperma apart te houden zonder dat deze de EP-procedure ondergaan). Eén dag na bevruchting hebben haploïde embryo's een korte lichaamsas en een onregelmatige morfologie van de hersenen en somi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Methoden voor in vitro fertilisatie en gynogenetische diploïden werden voor zebravis ontwikkeld door Charline Walker in het laboratorium van George Streisinger aan de Universiteit van Oregon in de jaren 70 en 80. De hier beschreven methode is ongewijzigd ten opzichte van de protocollen van Charline, die volledig beschikbaar zijn in The Zebrafish Book3.
Methoden voor in vitro fertilisatie en gynogenetische diploïden voor zebravis werden in de jaren 70 en 80 ontwikkeld door Charline Walker in het laboratorium van George Streisinger aan de University of Oregon. De hier beschreven methode is ongewijzigd ten opzichte van de protocollen van Charline, die volledig beschikbaar zijn in The Zebrafish Book3.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Horlogeglas | |||
| French Press | |||
| Drukcilinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteurpipetten | Het smalle uiteinde afsnijden, vuurpolissen | ||
| UV-crosslinker | |||
| microcapillairen |
Referenties
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
