Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

Samenvatting

Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de groei en stimuleren, met het vetzuur oleaat, van isotopisch zware en lichte S. cerevisiae cellen. Cellen worden gemalen met behulp van een cryolysis procedure in een kogelmolen molen en de daaruit voortvloeiende grindate gebracht oplossing van ureum oplosbaar. Deze procedure maakt het mogelijk om lysis van de cellen in een metabool inactieve toestand, met behoud van fosforylatie en het voorkomen van heroriëntatie van de phosphoproteome tijdens de cel lysis. Na de reductie, alkylering, trypsine vertering van de eiwitten, worden de monsters ontzout op C18 kolommen en het monster complexiteit verminderd door fractionering met hydrofiele interactie chromatografie (HILIC). HILIC kolommen bij voorkeur behouden hydrofiele moleculen die goed geschikt is voor phosphoproteomics. Gefosforyleerde peptiden hebben de neiging om later elueren in de chromatografische profiel dan de niet gefosforyleerde tegenhangers. Na fractionering, zijn fosfopeptiden verrijkt met behulp van geïmmobiliseerde metalen chromatografie, die zich baseert op lading op basis van affiniteit voor Phosphopeptide verrijking. Aan het einde van deze procedure de monsters zijn klaar om kwantitatief worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.

Protocol

Celgroei en media

1. Een enkele kolonie van BY4742Δarg4Δlys1 cellen 's nachts in 100 ml rijke media om een OD ₆₀₀ van 1,0 dan zaad in twee 1 liter culturen van een minimale gist medium (0,17% yeast nitrogen base, zonder ammoniumsulfaat of aminozuren, 0,5% ammonium sulfaat) met een volledige aanvulling van aminozuren, aangevuld met 20 mg / L van isotopisch normale of zware arginine ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4, Isotec) en lysine ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. De cellen werden gekweekt gedurende 18 uur, tot een OD ₆₀₀ van 1,8. Het is cruciaal dat de cellen gaan door minstens 9 generaties volledige opname van de gelabelde isotopen te bereiken. Het licht monster werd gepelleteerd, gewassen met steriel water, reseeded in een oleaat bevattend medium (isotopisch normale arginine en lysine, 0,2% oleaat (Sigma Chemicals) en 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) en gestimuleerd nog eens 85 minuten. Dit levert een isotopisch licht, met betrekking tot arginine en lysine, oleaat-gestimuleerde monster en een isotopisch zware glucose-grown referentiemonster.

Cell Lysis, isolatie en fractionering van peptiden

3. Weeg centrifuge fles. Oogst monsters door middel van centrifugeren gedurende 3 minuten. Verwijder de media en zuig overtollige vloeistof. Weeg pellet en een fles (zal typisch opbrengst tussen de 1-2 gram), dan knipperen vriezen in vloeibare stikstof. Voeg een volume dat overeenkomt met het gewicht van de pellet 'slijpen' buffer om de bevroren pellets in vloeibare stikstof (fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, Gibco), 10% glycerol, proteaseremmers (SigmaFast proteaseremmer Tabletten, Sigma) en HALT fosfatase-remmers (Thermo Scientific )).
4. Freeze het slijpen schip in vloeibare stikstof. Wacht tot de vloeibare stikstof ophoudt koken. Breng de pellet aan het malen vaartuig, met bevroren kogellagers.
5. Grind bij 600 rpm met een 1 min 20 sec cyclus met een richting omkering gedurende 3 minuten. Opnieuw invriezen het slijpen schip in vloeibare stikstof. Herhaal dit vier keer gedurende 15 minuten in totaal slijpen tijd.
6. Verzamel de bevroren grindate in een 50 ml Falcon buis plaatsen droog ijs. Bewaren bij -80 ° C tot klaar voor gebruik.
7. Maak een oplossing van 10 ml 8M ureum, 0,1 M ammoniumbicarbonaat, 0,1 M Tris pH 8,6. Voeg drie volumes van de ureum buffer tot een volume van het bevroren grindate (bijvoorbeeld 3mls van het ureum buffer toegevoegd aan een 1 gram pellet met 1 ml PBS buffer). Onmiddellijk ultrasone trillingen het mengsel met een sonde ultrasoonapparaat (2 - 10 seconden pulsen). Houd de tip de buurt van de bodem van de buis om te voorkomen dat schuimvorming van de oplossing. De grindate moet onmiddellijk in oplossing gaan.
8. Schakel het lysaat door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
9. Overdracht supernatant in de frisse buizen.
10. Maak een verse hoeveelheid van 0,5 M Tris [2-carboxyethyl] fosfine (TCEP). Voeg toe aan monster op 1:100 voor een 5mm uiteindelijke concentratie. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur
11. Alkylering van verminderde cysteines. Laat afkoelen tot kamertemperatuur. Maak een verse hoeveelheid van 1M joodacetamide. Houden in het donker (we de buis wikkelen in folie). Voeg toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 mm. Incubeer in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
12. Quench de joodacetamide met 20mm DTT van een 1M voorraad bij kamertemperatuur gedurende 1 uur
13. Kwantificeren van het eiwit met een standaard Bradford of BCA assay (niet beschreven). Neem een ​​monster voor analyse door middel van SDS PAGE hieronder.
14. Te valideren incorporatie van de zware isotopen, gebruik 100 ul van de gereduceerde en gealkyleerde lysaat. Verdunnen 1:4 met dH ₂ O, ultrasone trillingen en voeg trypsine op 50:1 eiwit trypsine. Digest voor een minimum van 4 uur, droge monster in een Speed ​​Vac en daarna ontzouten met een C18 Ultramicrospin de kolommen (The Nest Group).
    1. Hydrate kolom met 100 ul van acetonitril
    2. Equilibreren met 200 ul 0,1% TFA.
    3. Resuspendeer droge monster in 200 ul 0,1% TFA. Belasting op kolom. Centrifugeer op 200 xg ~ of de minimale snelheid die nodig is voor stroming door de kolom.
    4. Was tweemaal met 200 ul 0,1% TFA.
    5. Twee keer elueren met met 50 ul 60% acetonitril, 0,1% TFA.
    6. Monster in een Speed ​​Vac.
    7. Resuspendeer monster in 20 ul 0,1% mierenzuur. Run 2 ui op een massa-spectrometer. Controleer integratie van isotopisch zware arginine en lysine door een 10 en 8 Dalton verschuiving in de respectieve m / z spectra. De opname voor elk aminozuur moet tussen 96 - 98%.
15. Meng gelijke hoeveelheden (mg van eiwitten) van de isotopisch zware en lichte monsters.
16. Verdunnen sample 01:04 met 20% methanol.
17. Voeg trypsine op 1:200. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
18. Controleer of de spijsvertering is gegaan tot voltooiing door middel van SDS PAGE. Run 2 en 4 pl van de predigestion monster en 8 eend 16 ul van de post trypsine verteren. Visualiseren door Coomassie kleuring die de spijsvertering is voltooid. Als het niet compleet is, ultrasone trillingen van het monster met een sonde ultrasoonapparaat kort en te verteren weer met trypsine.
19. Droog het monster in een Speed ​​Vac. Bij het ​​droog 200 ul van gefilterd dH ₂ O en vortex toe te voegen tot de pellet in oplossing gaat. Droog monster in een Speed ​​Vac. Resuspendeer wederom met dH ₂ O. Weer droog monster.
20. Resuspendeer pellet in 0,1% trifluorazijnzuur (TFA, Sigma). Controleer of de pH-waarde is ongeveer 3 met behulp van pH-strips. Als zuur nodig met 10% TFA.
21. Pellet van de oplossing.
22. Ontzouten van de monsters op een Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18 kolom. Niet overbelasten deze kolommen. Het maximale bedrag is 5 mg maar het is beter te laden iets minder. Verdeel het monster over meerdere kolommen indien nodig.
    1. Hydrateren de kolom met 5 ml 100% acetonitril. Centrifugeer op 200 xg ~ of de minimale snelheid die nodig is voor stroming door de kolom.
    2. Evenwicht kolom met 5 ml 0,1% TFA. Belasting monster. Verzamel stroom en laad het opnieuw.
    3. Wassen met 5 ml 0,1% TFA. Herhalen.
    4. Elueren met 2ml 60% acetonitril, 0,1% TFA.
    5. Droog monster in een Speed ​​Vac.

Peptide Fractionering en isolatie van fosfopeptiden

1. Peptiden zijn gefractioneerd op een HILIC kolom. We maken gebruik van een Tosoh TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytische kolom met een bewaker kolom. Neem de tijd met deze stap, voert de kolom gedurende 2 uur bij 90% A voert u twee lege hellingen voordat u uw monster. De maximale belasting op een column van deze grootte wordt gedacht dat ongeveer XX, we meestal niet belasting meer dan 5 mg per run.
2. Oplosmiddel A - 98% ACN/0.1% TFA
   Oplosmiddel B - 2% ACN/0.1% TFA
   Belasting in 90% A meer dan 20 ', 90% A tot 85% A meer dan 5', 85% A tot 60% A meer dan 40 ', 60% A tot 0% A meer dan 5', 0% A tot 90% A over 5 '.
3. Het debiet is 1ml/min en fracties werden verzameld op 2 minuten met intervallen te beginnen bij de 85% A tot 60% A verloop.
4. Combineer fracties om het aantal fracties te verminderen tot 10. Verhoogde fracties zullen waarschijnlijk opleveren grotere dekking van de phosphoproteome.

Verrijking van fosfopeptiden

1. Fosfopeptiden zijn verrijkt met behulp van PHOS-Select Iron Affiniteit Gel. We aliquot onze IMAC hars om te voorkomen dat herhaalde vries ontdooien. Maak 50 ml van een 250 mM azijnzuur, 30% ACN belasting oplossing. Breng de pH op 2.7 met HCl. Resuspendeer pellets in 500 pi van de belasting-oplossing. Controleer de pH, aan te passen met HCl of NaOH als dat nodig is.
2. Voorwas 200 ul van IMAC kralen in een passende kolom. We maken gebruik van Molbiotec spin-kolommen.
   Voeg 15 ul van een 50% slurry (gel om de oplossing te laden) aan elke fractie, en incubeer de monsters voor 30 'met een eind over eind rotatie. Houd de stroom voor analyse.
3. Was de monsters 3 keer met last-oplossing en een keer met 500 ul gefilterd dH ₂ O.
4. Elueer peptiden met 2 - 3 min met 400 ul van 50 mM Na ₂ HPO ₄ (pH 8,4) buffer. Transfer naar een glazen flacon.
5. Verzuren tot pH 3 met 5 pi 100% mierenzuur, flash bevriezen in vloeibare stikstof, en gedroogde monster in een Speed ​​Vac.
6. Resuspendeer fosfopeptiden in 200 pi van 0,1% TFA en C18 schoon als hierboven beschreven. Droog naar beneden geëlueerd monsters in een Speed ​​Vac.
7. Resuspendeer peptiden in 20 pl van 0,1% mierenzuur. Gebruik 2 pi per massa-spectrometer analyse of als dat nodig is.

Opmerkingen

Voor veel van dit protocol dat u zult werken 'blind'. De cel lysis kan worden gecontroleerd door western blotting en Bradford of BCA testen, en de trypsine spijsvertering kan ook gemakkelijk worden beoordeeld. De HILIC kolom gaf een trace vergelijkbaar met deze, of zoals door anderen gezien [1, 2] afhankelijk van de vloeistofchromatografie machine die wordt gebruikt. Monsters worden gecontroleerd door massa-spectrometrie, test je samples op goedkope machines, zoals LCQs of MALDIs voordat je naar de hoge kosten analyses op een hoge nauwkeurigheid van massa's, hoge resolutie machine. Tenslotte, indien u een droging in een monster met een zuur in, gebruik dan glas.

Discussie

Deze methode levert een verrijking van fosfopeptiden die kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Een aantal parameters kunnen worden gewijzigd in dit protocol, maar het belangrijkste aspect om te onthouden is om het behoud van uw fosforylatie. Voorbereiding van de cellen voor de kwantificering kan worden bereikt in een aantal verschillende manieren, bijvoorbeeld als je niet kunt uw cellen label in vivo, tags zoals ICAT [3] of ITRAC [4] kan gebruikt worden na de winning tot differentieel label twee culturen voo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isotec™ L-arginine-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-lysine-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 7,4 (10X) vloeistof	Invitrogen	70011044
SigmaFAST Protease Remmer Tabletten	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Retsch PM100 kogelmolenmaalmachine	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml maalbeker van roestvrij staal	Retsch	01.462.0148
Ultramicrospin C18-kolom	De Nest Groep	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytische kolom	Tosoh Corp.	13071	Dit is de HILIC-chromatografische kolom.
Guardkolom 4,6 mm ID x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Wij raden deze guardkolom aan om de levensduur van uw HILIC-kolom te verlengen.
PHOS-Select™ IJzeraffiniteitsgel	Sigma-Aldrich	P9740	Dit is de IMAC-hars. Verdeel in aliquoten en bewaar.