Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Summary

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Abstract

Volledig inzicht in de mechanismen van levende cellen kan alleen worden bereikt door het onderzoeken van de belangrijkste processen die uitlokken en gebeurtenissen direct op een cellulair niveau. Tot op heden is de schuifspanning complexiteit van biologische systemen heeft veroorzaakt precies single-molecule experimenten te ver veeleisend zijn, in plaats daarvan concentreren op studies van enkele systemen met behulp van relatief ruwe bulk ensemble-gemiddelde van metingen. Echter veel belangrijke processen zich voordoen in de levende cel op het niveau van slechts een of enkele moleculen; ensemble metingen over het algemeen het masker van de stochastische en heterogene karakter van deze gebeurtenissen. Hier, met behulp van geavanceerde optische microscopie en analytische beeldanalyse tools die we laten zien hoe eiwitten binnen een enkel levend bacteriële cel met een precisie van enkele moleculen en hoe we kunnen de dynamiek binnen de moleculaire complexen te observeren in het functioneren van biologische machines te controleren. De technieken zijn direct relevant zijn fysiologisch. Ze zijn minimaal-perturbatieve en niet-invasieve aan het biologische monster onder studie en zijn volledig afgestemd voor het onderzoek in levend materiaal, functies die niet direct beschikbaar zijn voor andere single-molecule benaderingen van biofysica. Daarnaast is de biologische monsters bestudeerde alle fluorescent-gelabelde eiwit te produceren op een niveau dat bijna identiek is aan de ongewijzigde celstammen ("genoom encoding"), in tegenstelling tot de meer gebruikelijke, maar minder ideale aanpak voor het genereren van aanzienlijk meer eiwitten dan zou van nature voorkomen ('plasmide expressie'). Dus de werkelijke biologische monsters die zullen worden onderzocht zijn aanzienlijk dichter bij de natuurlijke organismen, en dus de waarnemingen meer relevant zijn voor echte fysiologische processen.

Protocol

1. Om te beginnen deze procedure, 50 ul van bevroren voorraden van fluorescerende eiwitten te drukken Escherichia coli bacteriële cellen worden eerst ontdooid en aëroob gegroeid met schudden in 5 ml LB groeimedia 's nachts bij 37 graden C. In de ochtend, wordt 50 ul van deze verzadigde cultuur onttrokken en sub-gekweekt in de minimal M63 glucose cultuur media, incuberen bij 30 ° C gedurende 4 tot 6 uur. Hier laten we zien met twee verschillende cel-stammen, waarvan er een uitdrukking een elektron-transport van cytochroom gefuseerd met GFP, de andere die een eiwit dat betrokken is in het bacteriële flagellaire motor gefuseerd met GFP uitdrukt.
2. Cellen kunnen ofwel ....

Discussion

Zorg moet worden genomen om geen "over shear" cel om naar te kijken aangebonden bacteriën, aangezien dit afbreuk doen aan de functionaliteit van de flagellaire motoren. Het is belangrijk om cellen die een keer te gebruiken voor veel langer dan een uur op de microscoop slide, omdat ze kunnen worden zuurstof uitgeput. Aanzienlijke optimalisatie kan nodig zijn om de beste imaging microscoop voorwaarden afgestemd op uw specifieke biologisch systeem in onderzoek. Het kan verstandig zijn om de beeldvorming met behul.......