Dissectie van 6,5 dpc muizenembryo's

Samenvatting

Isolatie van postimplantatie-stage embryo's maakt het mogelijk om genen patronen te bestuderen en cel-afkomst besluitvorming tijdens de embryonale ontwikkeling te analyseren, maar een goede dissectie van het vroege embryo kan een uitdaging zijn. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van vroege primitieve-streep-stadium embryo's (~ 6,5 dagen na de coitum [DPC]).

Samenvatting

Analyse van genexpressie patronen tijdens de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling van zoogdieren kan belangrijke aanwijzingen over genfunctie, cel-cel interactie en signaleren mechanismen die leiden embryonale patronen. Echter, dissectie van de muis embryo van de decidua kort na de implantatie een uitdagende procedure, en gedetailleerde stap-voor-stap documentatie van dit proces ontbreekt.

Hier laten we zien hoe de post-implantatie (6,5 dpc) embryo's worden geïsoleerd door eerst het ontleden van de baarmoeder van een zwangere muis (detectie van de vaginale plug was aangewezen dag 0,5 poist coitum) en vervolgens ontleden van het embryo uit het maternale decidua. De ontleding van membraan Reichert is beschreven, evenals de verwijdering van de ectoplacental kegel.

Protocol

Dissectie van de voortplantingsorganen van een vrouwelijke muis

1. Drachtige dieren worden gedood door de CO ₂ stikken met behulp van samengeperst gas.
2. Leg het dier rugligging op absorberend kussen en laat deze in 70% ethanol om het risico van besmetting van de dissectie met de muis haar te verminderen.
3. Knijp de huid en maakt een kleine incisie aan de laterale middellijn met regelmatige chirurgische schaar. Houd de huid stevig vast boven en onder de incisie en uit elkaar te trekken van de huid in de richting van het hoofd en staart naar de buik bloot te leggen.
4. Pak het buikvlies met een tang en snijd de buikholte bloot te leggen.
5. Zoek de voortplantingsorganen in het dorsale gebied van de lichaamsholte: twee baarmoeder hoorns, de eileider en de eierstokken.

Primitieve Streak-fase (6.5 dpc) Dissection

1. Verwijder de baarmoeder hoorn van de baarmoeder vast te pakken onder de eileider en snijd het gratis langs de mesometrium. Plaats ontleed baarmoeder in ijskoud PBS.
   
   
   
   Figuur 1
   
   
2. Scheid elk embryo door te snijden tussen de implantatie plaatsen langs de baarmoeder hoorn.
   
   
   
   Figuur 2
   
   
   
3. Pak de gespierde baarmoederslijmvlies door te schuiven horlogemakerij pincet tussen de omringende spierlaag en gehuld decidua weefsel. Trek de spierlaag, het blootstellen van de decidua.
   
   
   
   Figuur 3
   
   
4. Knip een deel van de blootgestelde decidua aan de top (ongeveer 1 / 5 van de decidua weefsel) die de midventral of distale tip van de bijgevoegde embryo bloot te leggen.
   
   
   
   Figuur 4
   
   
5. Het embryo kan worden beschoten met behulp van de tips van de tang. Doorboren van de decidua met een tang rond de embryo en open tang uit elkaar scheuren decidua.
   
   
   
   Figuur 5
   
   
6. Zodra embryo wordt verwijderd, kan Reichart membraan nog steeds zo goed zijn bevestigd als de ectoplacental kegel (trofoblast). Het embryo kan verder worden ontleed door zorgvuldige dissectie.
   
   
   Figuur 6
   

Discussie

Postimplantatie in de muis optreedt tussen 4,5 dpc en geboorte. Deze dissectie methode kan worden toegepast, in hoofdzaak zoals beschreven, om eerder of later stadium embryo's te isoleren op 5,5-8,5 DPC.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microdissectie-pincetten, gekarteld, recht	Instrument	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 paar
Microdissectie-pincetten Model #55 INOX	Instrument	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 paar
Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x)	Reagens	Invitrogen	14190
Fisherbrand steriele polystyreen petrischaal	Instrument	Fisher Scientific	08-757-12
4% paraformaldehyde in PBS	Reagens
Rechte dissectieschaar met scherpe punt	Instrument	Fisher Scientific	08-940
Drachtige vrouwelijke muizen	Dier
Dissectiemicroscoop	Microscoop