A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

Samenvatting

Beschrijven we een nieuw rood fluorescerend eiwit (RFP) reporter dat specifiek wordt uitgedrukt in de Drosophila Oog. We detail een methodologie voor dissectie van het oog denkbeeldige schijf en hoe deze verslaggever kan worden gebruikt om steun in de dissectie en identificatie van specifieke celtypes in de zich ontwikkelende oog.

Protocol

1. Plaats eerst een druppel PBS op een Sylgard schotel onder een dissectie microscoop.
2. Volgende verwijder enkele omzwervingen derde instar larven uit een flacon of fles met behulp van een spatel en plaats ze in het PBS.
3. Om te beginnen de dissectie met je linkerhand een pincet (als je rechts bent overhandigd) om een ​​larve greep twee derde van de weg naar de achterkant en dan het andere paar te gebruiken om de donker gekleurde mond haken houden aan het voorste einde.
4. Nu voorzichtig uit elkaar te trekken van de larve door het bewegen van beide paren een pincet uit de buurt van elkaar. De monddelen moet uit de buurt komen van de rest van het lichaam met het oog / hersenen complex bevestigd.
5. Om het oog schijven voor immunofluorescentie vast de schijven op dit moment vlek door ze te plaatsen in 4% paraformaldehyde / PBS-oplossing gedurende 30-45 minuten op ijs. Was daarna de schijven vier keer met PBST en vlek vervolgens met de juiste antilichamen.
6. Het is het makkelijkst voor het oog schijven ontleden direct op een dia. Breng een druppel PBS op een dia en verplaats de schijven om de druppel PBS door die de monddelen.
7. De imaginaire weefsels zijn doorzichtig en dus in eerste instantie het oog schijven zijn moeilijk te identificeren. Om het gemakkelijker te herkennen hen een dissectiemicroscoop gebruik met fluorescentie mogelijkheden. Met behulp van de eye-RFP reporter lijn in het oog schijven is duidelijk te zien als rood fluorescerend weefsel overlappen de sferische optische kwabben (zie figuur 1).
8. Als u een fiber optic koude lichtbron met behulp van direct het licht onder een schuine hoek aan de dia, omdat dit zal de schijven groter contrast. Het oog / antennale schijven zijn aangesloten op de optische kwabben via de optische steeltje op het achterste en naar de monddelen via een steeltje uit de antennaal schijf op de voorste.
9. Om ontleden het oog schijven houdt u de monddelen met behulp van een pincet en gebruik de andere paar op het oog schijven te scheiden van de larven hersenen. Volgende scheiden de ogen schijven uit de monddelen. Verwijder tenslotte de monddelen van de dia als deze kunnen de dekglaasje voorkomen plat.
10. Als u ontleed alle oog schijven voorzichtig de slide kantelen en droog het overtollige PBS. Voeg dan een druppel Vectashield en voorzichtig plaats een dekglaasje bovenop.
11. De schijven zijn nu klaar om te worden afgebeeld door een van beide epifluorescentie of confocale microscopie (figuur 2).

Representatieve resultaten

Wanneer correct ontleed in het oog / antennaal schijf moeten plat liggen op de dia uit de buurt van een vreemde weefsel zoals de hersenen. De dorsale en ventrale polen van het oog schijf zijn gebogen en zo hebben de neiging op te vouwen, maar dit kan worden voorkomen door het nemen van een Z-serie over een confocale microscoop en het weglaten van deze onderdelen van de projectie. Hoewel de schijf is een monolaag epitheel de variabele posities van de kernen moet een Z-serie projectie om een ​​algemeen beeld van de schijf te krijgen. Een projectie van een typisch eye-RFP ogen / antennale schijf genomen op een confocale microscoop wordt weergegeven in figuur 2. We nemen meestal een urn secties door de schijf met behulp van een 20x of 40x lens. Het oog-RFP reporter is kernenergie gelokaliseerd en zo het patroon te zien in Figuur 2 geeft de kernen van de cellen die RFP.

Figuur 1. Eerste dissectie van het oog / hersenen complex van een eye-RFP derde larvestadium Drosophila larven. Het oog / antennale verbeelding disc (geschetste) gezien kan worden bevestigd aan de monddelen (MP) en bedekken de optische kwab (OL) van de hersenen. Het beeld werd gemaakt met behulp van een fluorescentie microscoop om het ontleden van de RFP uitdrukking in het oog disc te tonen. Anterior is aan de linkerkant. Schaal bar: 300 pm.

Figuur 2. Expressie van de eye-RFP reporter in het oog imaginaire disc. Een derde instar oog (ED) / antennale schijf (AD) ontleed van een eye-RFP larve met RFP expressie (rood). De schijf werd gekleurd met phalloidin (groen), die vlekken apicale celoppervlak en toont de morfogenetische groef (pijlpunt). RFP wordt uitgedrukt in voorloper cellen rondom de MF, in fotoreceptoren 1,6,7 en in de kegel cellen. Anterior is aan de linkerkant. Schaalbalk: 25 pm.

Discussie

Dissectie van de Drosophila oog denkbeeldige schijf is eenvoudig, maar kan de tijd nemen om te beheersen. De kritische stappen zijn de identificatie van het oog schijf en de dissectie uit de buurt van het larvale hersenen. Identificatie van het oog schijf is eenvoudiger met behulp van de eye-RFP lijn hier. Eventuele wijzigingen zijn aan de antennaal schijf of de peripodial membraan te verwijderen, of om de optische kwab aan de PR-axonen het invoeren van de hersenen te visualiseren verlaten.