Method Article

Live-dissectie van Drosophila Embryo's: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring

DOI:

10.3791/1647

December 29th, 2009

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een gestroomlijnde protocol voor het genereren van "filet" bereidingen van Drosophila embryo's van bepaalde genotypen. Dit protocol maakt een efficiënte uitvoering van een variëteit van genetische screens. Het maakt ook een uitstekende visualisatie van structuren in de late embryo.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila embryo's tussen de etappes 14 en 17 van de embryonale ontwikkeling kan gemakkelijk worden ontleed om "filet" preparaten te genereren. In deze voorbereidingen, het centrale zenuwstelsel loopt in het midden, en wordt geflankeerd door het lichaam muren. Veel verschillende fenotypes zijn onderzocht met behulp van een dergelijke preparaten. In de meeste gevallen werden de filets gegenereerd door ontleding van antilichaam-gekleurde vaste hele-mount embryo's. Deze "vaste dissecties" hebben een aantal nadelen, echter. Ze zijn tijdrovend uit te voeren, en het is moeilijk om mutant (GFP-negatief) embryo's sorteren van voorraden waarin mutaties in de loop der GFP balancer chromosomen. Sinds 2002 is onze groep is het uitvoeren van een tekort en ectopische expressie schermen om liganden voor weesreceptoren te identificeren. Om dit te doen, we ontwikkelden gestroomlijnde protocollen voor de live-embryo dissectie en antilichaam kleuring van collecties met honderden gebalanceerde lijnen. We hebben geconcludeerd dat het aanzienlijk efficiënter om fenotypes in grote collecties van de voorraden te onderzoeken door live dissectie dan door vaste dissectie. Met behulp van het protocol hier beschreven, kan een enkel individu opgeleid tot het scherm tot 10 lijnen per dag voor fenotypes, onderzoek 4-7 mutant embryo's van elke regel onder een samengestelde microscoop. Dit maakt de identificatie van mutaties die een subtiele, lage penetrantie fenotypes, omdat tot 70 hemisegments per lijn worden gescoord bij een sterke vergroting met een 40X water-immersie lens.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Introductie

Drosophila embryo's tussen de etappes 14 en 17 van de embryonale ontwikkeling kan gemakkelijk worden ontleed om "filet" preparaten te genereren. In deze voorbereidingen, het centrale zenuwstelsel (CZS) loopt in het midden, en wordt geflankeerd door het lichaam muren. De darm is verwijderd. Na kleuring met antilichamen, filets maken veel betere visualisatie van het centrale zenuwstelsel en het lichaam muur structuren (bijv. motor axonen, spieren, perifere sensorische (PNS) neuronen, luchtpijp) dan hele-mount embryo's, omdat er geen weefsel tussenliggende tussen de voorbereiding en de dekglaasje, en omdat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hopen dat deze video demonstratie heeft onze methoden weergegeven voor live-embryo dissectie en kleuring in voldoende detail dat ze nu gemakkelijk kan worden uitgevoerd door een persoon die enige ervaring heeft in Drosophila genetica en embryologie. Natuurlijk zullen veel praktijk nog steeds nodig zijn, vooral voor de dissecties zelf. In onze ervaring, zal iedere persoon die leert de live-dissectie methoden creëren een subtiel ander dissectie protocol waarmee hij / zij het snelst het genereren van hoge kwali.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Nicki Fox en Aloisia Schmid voor hun bijdragen aan ontwikkeling van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door een NIH RO1 te verlenen aan KZ, NS28182.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Borosilicate Tubing With Filament Sutter Instrument Co.BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle pullerNarishige InternationalTubes pulled using a heater level of 58.9

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  2. Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Embryo DissectionLive Embryo StainingAntibody Staining ProtocolMutant Line ScreeningGFP Balancer ChromosomesCompound Microscopy AnalysisWax Rectangle SlideDouble Sided TapeGrape Agar PlateImmunofluorescence Microscopy

Related Articles