We zullen laten zien hoe te knipperen de reacties op te nemen van enkele muis kegels met behulp van een zuig-elektrode.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Staafjes en kegeltjes fotoreceptoren in het netvlies zijn verantwoordelijk voor het licht detectie. In de duisternis, cyclisch nucleotide-gated (CNG) kanalen in de buitenste segment zijn open en laten kationen gestaag naar binnen stromen over het membraan, depolariserende de cel. Blootstelling aan licht leidt tot de sluiting van de CNG-kanalen, blokkeert de innerlijke kation stroom, en dus resulteert in een cel hyperpolarisatie. Op basis van de polariteit van fotoreceptoren, was een zuig-opname methode ontwikkeld in 1970 dat, in tegenstelling tot de klassieke patch-clamp techniek, vereist geen penetreren van de plasmamembraan
Protocol
Het maken van elektroden
- Maak de registrerende elektroden met behulp van een micropipet trekker en poets de elektroden met verwarming gloeidraad onder de microscoop. Voor muis kegel eencellige zuig-opname, de binnenste diameter van de elektrode tip is ongeveer 6-7 um.
- Bereid referentie-elektroden. Weeg 1% agar in gedistilleerd water. Smelt de agar-oplossing in warm water bad. Vul de glazen pipetten (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) met 1% agar met behulp van spuit. Stollen van de agar bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Snijd de pipetten in twee helften met behulp van een diamant mes.
- Genieten van de referentie-elektrod....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Single-cell zuig opname van fotoreceptorcellen was drie decennia geleden ontwikkeld. Het stelt ons in staat om op te nemen trans-membraan huidige verandering veroorzaakt door licht stimulatie, zonder het penetreren van de celmembraan. Vanwege de hoge cel-cel adhesie, is het moeilijk om gezond single staafjes en kegeltjes isoleren van de muis netvlies, zoals amfibieën retina en het is moeilijk te vinden individuele kegels te wijten aan het lage percentage (3%) en de kleine omvang. De binnenste-segment-in (IS-in) opname m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Ondersteund door Career Development Award van Onderzoek om Blindheid, NIH subsidie EY 019312, en de onbeperkte subsidie Voorkomen Onderzoek om Blindheid en EY 02.687 (Department of Ophthalmology & Visual Sciences aan de Washington University) te voorkomen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Referenties
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
