Dit protocol beschrijft een procedure voor het identificeren en ontleden van organen van de volwassen zebravissen.
Methodenartikel
Dissectie van organen van de Adult zebravis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de afgelopen 20 jaar is de zebravis een krachtige modelorganisme voor het begrijpen van gewervelde dieren ontwikkeling en ziekte. Hoewel de experimentele analyse van het embryo en de larve is uitgebreid en de morfologie is goed gedocumenteerd, zijn beschrijvingen van de volwassen zebravissen anatomie en studies van de ontwikkeling van de volwassen structuren en organen, samen met de technieken voor het werken met volwassenen ontbreekt. De organen van de larve ondergaat belangrijke veranderingen in hun algemene structuur, morfologie, en anatomische locatie tijdens de larvale tot volwassen overgang. Extern, de transparante larve ontwikkelt zijn karakteristieke volwassen gestreepte pigment patroon en de gepaarde buikvinnen, terwijl intern de organen ondergaan enorme groei en remodeling. Daarnaast heeft de bipotential gonaden primordium ontwikkelt zich tot een testis of eierstokken. Dit protocol geeft een groot aantal van de organen van de volwassen en toont methoden voor dissectie van de hersenen, gonaden, gastro-intestinale systeem, hart en nieren van de volwassen zebravissen. De ontleed organen kunnen worden gebruikt voor het in situ hybridisatie, immunohistochemie, histologie, RNA-extractie, eiwit analyse en andere moleculaire technieken. Dit protocol zal helpen bij de verbreding van studies in de zebravis om de verbouwing van de larvale organen, de morfogenese van organen die specifiek zijn voor de volwassen en de andere onderzoeken van de volwassen orgaansystemen op te nemen.
Protocol
- Een mannelijke zebravissen zullen eerst worden ontleed, gevolgd door een vrouwelijke vis. Voor het begin van de dissectie, verdooft een vis in 0,2% tricaïne en dan euthanaseren door incubatie in ijs water gedurende 15 minuten.
- Begin met het zachtjes tikken van de vis droog op een papieren handdoek en het op een dissectie mat. Extern, zebravis hebben een rug-, anale en staartvinnen en gekoppeld borstvinnen en buikvinnen (figuur 1).
Figuur 1. Volwassen mannelijke vissen met vinnen gelabeld. - Speld de vis aan de ontleden mat door het vlezige deel van de staart en het ventrale deel van de oogkas.
- Snip de huid op de buik van de vis net anterieur van de anaalvin. Snijd de huid en de onderliggende spieren langs de buik van de aarsvin naar de operculum (de harde die meer dan de kieuw) (figuur 2, stap 1).
Figuur 2. Stappen in het verwijderen van huid en lichaam muur spier interne organen bloot te leggen. - Verwijder vervolgens het operculum en de borstvin, inclusief de borst gordel (de dikke, benige streek aan de voet van de fin) (Figuur 2, stap 2). Snijd de huid en de onderliggende spieren beginnen van boven de nu bloot kieuw achterzijde langs de zijkant van de vis en dan naar beneden naar de anaalvin (figuur 2, stap 3).
- Verwijder voorzichtig de huid en de onderliggende spieren van de kant van de vis. Veel van de inwendige organen zijn nu zichtbaar (zie figuur 3).
Figuur 3. Volwassen mannelijke vissen met het lichaam wand-en spier verwijderd waardoor de visualisatie van de interne organen. - De testes zijn lang, wit, gepaarde organen die verbonden zijn aan de dorsale lichaamswand. Verwijder een testis en plaats deze in een schotel van PBS. Onderzoek de testis met gereflecteerde licht van de testes (figuur 4), die cysten bevatten met verschillende stadia van de ontwikkeling van kiemcellen van spermatagonia tot spermatiden (Leal et al.., 2009) te visualiseren.
Figuur 4. Dissectie van een testis. De witte rondachtig structuren zijn de testes. - Verwijder vervolgens het gastro-intestinale systeem van de lichaamsholte van de vis. De lever kan worden geïdentificeerd door zijn grote omvang, gelobde morfologie, tannish kleur, en uitgebreide vascularisatie. De galblaas, een groene doorschijnende met vloeistof gevulde zak, en de milt, die helder rood wordt weergegeven, zijn te vinden in de ingewanden.
- Scheid de darm van de rest van de organen en rek het uit. De voorste, midden en achterste delen van de darm worden bepaald door de hoogte van de epitheliale plooien (Wallace et al., 2005)..
- Leg een stukje van de darm in PBS en observeer de epitheliale plooien met behulp van doorvallend licht.
- Vervolgens onderzoekt de zwemblaas. De zwemblaas bestaat uit een achterste kamer, die is aan de slokdarm via de pneumatische buis, en een voorste kamer, die is naar het binnenoor aangesloten via de Weberiaanse apparaat (Finney et al., 2006)..
- Verwijderen en gooi de zwemblaas. Losmaken van de vis-en re-pin het ventrale zijde bovenaan is om de nier, die is gelegen langs de dorsale lichaamswand ontleden. De nier is een doorschijnend roze structuur in verband met de dorsale aorta en gepigmenteerde cellen. De nier is verdeeld in hoofd, lichaam en staart regio's (figuur 5). Ontleden van een stukje van de nier en plaats het in PBS. Plagen elkaar de nieren weefsel om de nierbuisjes onthullen.
Figuur 5. Locatie van het hoofd, lichaam en staart nieren langs de dorsale lichaamswand. - Ontleden een vrouwelijke vis. Zoals eerder beschreven, euthanaseren de vis in ijs water en dep het droog is voordat het aan de pinning ontleden mat. Verwijder het vel van de kant van de vis, zoals eerder aangetoond. De eierstok is een bilobed structuur die in het lichaam holte opgeschort door een gevasculariseerde mesovarium.
- Verwijder een lob van de eierstok, plaats het in PBS, en onderzoeken met doorvallend licht. De eicellen kunnen uit elkaar worden geplaagd met behulp van fijne naalden en dan geënsceneerde (Figuur 6, Selman et al.., 1993). Fase I eicellen zijn ongeveer 10 - 150 micron in omvang en doorschijnend. Fase II eicellen zijn circa 150 - 350 micron in omvang en wordt gedefinieerd door de verschijning van corticale granules. Fase III eicellen zijn 350 tot 750 micron groot en ondoorzichtig te wijten aan de accumulatie van dooier. Volwassen stadium IV en V eicellen zijn doorzichtig en over het algemeen niet gevonden in de eierstokken van de vrouwtjes die onlangs hebben gepaard.
Figuur 6. Live stadium I, II en III eicellen waargenomen onder eenontleden microscoop met doorvallend licht. - Vervolgens ontleden het hart van de vis. Het hart bevindt zich posterior en ventraal op de kieuw. Begin met het uitsnijden van het hart en alle omliggende weefsel en te plaatsen in PBS. Voorzichtig ontleden weg het weefsel rondom het hart, zorg dat u de delicate atrium schade.
- Plaats de ontleed hart in Ringer-oplossing om de hartslag te observeren.
Identificeer het atrium, ventrikel, en de bulbus arteriosus (figuur 7, Hu et al., 2001)..
Figuur 7. Ontleed volwassen hart. - Voltooi de dissectie door het verwijderen van de hersenen van de vis. Begin met het unpinning de vis en het verwijderen van het hoofd met een scheermesje. Verwijder zoveel weke delen mogelijk van de ventrale zijde van de schedel met een tang. Verwijder de ogen met behulp van kleine lente schaar. Open te breken van de schedel en verwijder het bot van de ventrale zijde van de hersenen. Plaats nu het hoofd in een schotel van PBS en verwijder de huid en schedel botten van de dorsale zijde van de hersenen.
- Identificeer de olfactorische bollen, telencephalon, habenula, optische Tectum, cerebellum en merg (figuur 8, Wullimann et al., 1996;. Schilling, 2002).
Figuur 8. Ontleed volwassen zebravis hersenen. Dorsaal aanzicht, anterior naar boven.
Openbaarmakingen
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01 HD050901 aan MCM en American Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041-01-DDC naar TG.
Materialen
Reagentia:
0,2% tricaïne (ethyl-3-aminobenzoaat)
200 mg poeder tricaïne
97,9 ml water DD
~ 1 ml 1 M Tris (pH 9)
Pas de pH tot 7,0
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
4,0 g NaCl
0,1 g KCl
100 ml 0,1 M PO 4 Buffer, pH 7,3
150 ml dH 2 O
Ringers-oplossing
6.7g NaCl
0,2 g KCl
0,2 g CaCl 2
1,2 g Hepes
Een LH 2 O
Pas de pH op 7,2
Uitrusting:
Ontleden schotel met mat
Electron Microscopy Sciences
catalogus # 70540
Vannas voorjaar schaar
Fijn Science Tools
catalogus # 91500-09
Referenties
- Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
- Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
- Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
- Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
- Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).
Herprints en machtigingen
