Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Samenvatting

Procedure voor bemesting Xenopus oöcyten Door de host overdrachtmethode.

Samenvatting

Het bestuderen van de bijdrage van de moeder geërfd moleculen tot de vroege ontwikkeling gewervelde wordt vaak gehinderd door de tijd en kosten die nodig zijn om de moeder-effect mutant dieren te genereren. Bovendien, veel van de technieken om overexpressie of genfunctie remmen in organismen zoals Xenopus en zebravis niet voldoende kritische doelgroep van moeders signaalwegen, zoals de Wnt-signalering. In Xenopus, kan manipuleren genfunctie in gekweekte eicellen bevruchten en vervolgens te verbeteren deze problemen tot op zekere hoogte. Eicellen worden handmatig defolliculated van donor eierstok weefsel, geïnjecteerd of worden behandeld in de cultuur als gewenst, en vervolgens gestimuleerd met progesteron tot rijping te induceren. Vervolgens worden de eicellen ingebracht in de lichaamsholte van een eisprong gastheer vrouwelijke kikker, waarna ze zullen worden getransloceerd via eileider van de gastheer en het verwerven van modificaties en gelei lagen nodig zijn voor de bevruchting. De resulterende embryo's kunnen vervolgens worden verhoogd tot het gewenste stadium en geanalyseerd op de gevolgen van een eventuele experimentele verstoringen. Deze host-transfer methode is zeer effectief in het blootleggen van fundamentele mechanismen van de vroege ontwikkeling en maakt een breed scala aan experimentele mogelijkheden niet beschikbaar in alle andere gewervelde modelorganisme.

Protocol

1. Chirurgische verwijdering van de eierstokken Tissue

1. Maak een nieuwe partij van eicel kweekmedium (OCM, Materials), tussen 400 tot 800 ml, afhankelijk van de grootte van het experiment. Stel de pH op 7,6-7,8, totdat de fenol rood wordt een donkere rode kleur (zes of zo kleine druppeltjes van 5 N NaOH). Giet een klein bedrag om de pH te controleren in een aparte buis, omdat de pH-elektrode schadelijk zijn voor de media. OCM moet worden bewaard bij 18 ° C en binnen een week.
2. Selecteer 3-5 vrouwtjes en een plaats in ~ 2L gebufferde verdoving oplossing (Materials). We proberen te vermijden met behulp van kikkers die werden gevoerd op de dag van of voorafgaand aan de operatie. Terwijl de kikker is toegeven aan de narcose, ontsmet de chirurgische gebied met 70% EtOH en de voorbereiding van de chirurgische instrumenten.
3. Steriliseer de chirurgische instrumenten door 20-seconden onderdompeling in een hete kraal sterilisator op 250 ° C. De volgende instrumenten moeten worden bij de hand: scalpel handvat (# 3) en blad (# 10 of 11), een aantal paren van Dumont forceps, Bonn iris schaar (gebogen of recht), Halsey of Olsen-Hegar micro naaldhouder en hechtingen. Plaats gesteriliseerde instrumenten op een steriele petrischaal of aan de binnenkant van de hechting pakket te houden steriel. Pak de naald in de naaldhouder in de gewenste richting voordat u begint. Wij geven de voorkeur Olsen-Hegar naald houders, omdat het handvat bevat schaar bladen, die kan worden gebruikt om de hechtingen trimmen zonder over te schakelen instrumenten.
4. Na 10 minuten, controleer dan of een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt. Onder narcose kikkers zullen stoppen met bewegen en zal niet reageren op een teen knijpen of wordt omgedraaid. Anesthesie moet duren 15 minuten, dat is meer dan genoeg tijd om de bewerkingen uit te voeren. Don juiste chirurgische kleding. Dit kan onder meer schone handschoenen (niet-latex), laboratoriumjassen, en chirurgische maskers, afhankelijk van persoonlijke voorkeur en institutionele verzorging van dieren richtlijnen.
5. Opmerking over aseptische techniek: Kikker huid secreties bevatten antimicrobiële peptiden die in het algemeen de incidentie van besmetting te beperken tijdens de operatie, hoewel aseptische techniek moet worden gevolgd zoveel mogelijk. Chirurgisch afdekmateriaal kan worden gebruikt, maar kan niet worden verplicht door institutionele IACUCs en mogen niet veel voordeel. Over het algemeen "tip techniek" gebruikt, waarbij de handen niet raken de steriele tips van de instrumenten, hechtmateriaal of incisie site. Instrumenten kunnen worden gesteriliseerd (in de kraal sterilisator) na het insnijden van de huid, en een steriele ruimte dient te worden gehandhaafd op het werkblad voor het plaatsen van instrumenten (zoals een petrischaaltje of hechting pakket). Institutionele vereisten kunnen aanzienlijk verschillen, het is volg je de instellingen richtlijnen en een passende instructies voor het uitvoeren van operaties.
6. Haal de kikker van de verdoving en plaats in de dorsale decubitus op een vochtige chirurgische schoon te vegen. Let op. De huid kan worden gereinigd door spoelen in verdunde povidine jodium (1:20) of chloorhexidine (0,75%). Echter, voorkomen dat commercieel chirurgische scrubs, zeep en 70% isopropylalcohol, omdat deze de gevoelige huid van amfibieën schade.
7. Met behulp van een scalpel of een klein iris schaar, een kleine (1 - 1,5 cm) sneetje in de huid in het onderste deel van de buik, lateraal van de middellijn. Latere incisies op dezelfde kikker moet worden uitgevoerd aan verschillende kanten, zowel op afstand van elkaar. Incisies kunnen gedaan worden parallel of loodrecht op de middellijn.
8. Maak de huid en de buikspier insnijdingen in twee fasen. Na het snijden van de huid, tilt u de spierlaag en de omliggende wit-gekleurd fascia met een pincet en maak de incisie in de verhoogde spier. Gebruik een schaar en knip recht naar beneden, proberen om een ​​snelle gesneden om de lichaamsholte waardoor schone wondranden bloot te leggen. Als alleen de fascia wordt gesneden, zal het intrekken en zal hechten moeilijker. Het opheffen van de spier zal helpen voorkomen dat per ongeluk verwonden alle interne organen. Probeer ook om te voorkomen dat het doorsnijden van enige zichtbare lymfe hart of de bloedvaten in de spier lagen. Verleng de lengte met een schaar van de incisie, zodat eierstok kan gemakkelijk worden door getrokken.
9. Eierstok moet duidelijk zichtbaar zijn zodra de incisie wordt gemaakt. Aan te schaffen de eierstok, pak met een pincet en externaliseren de eierstok weefsel. De gewenste hoeveelheid weefsel is verwijderd, en afgesneden op het niveau van het lichaam muur. Niet terug spul het weefsel in de holte coelomic, want dit kan een bron van infectie of andere complicaties zijn.
10. Onmiddellijk zien een klein stukje eierstok onder een dissectiemicroscoop en defolliculate een paar eicellen om hun kwaliteit te testen. Ze moeten stevig en van gelijke grootte en kleur. Als ze aanvaardbaar zijn, verwijdert u de gewenste hoeveelheid van de eierstok weefsel en hechtdraad de incisie. Genoeg om een ​​90 mm petrischaal te vullen is meestal voldoende voor de meeste experimenten. Als de eicellen zijn van twijfelachtige kwaliteit, hechtdraad de kikker en herhaal met een andere vrouw.
11. Sluit de incisie door hechten de spieren en fascia laag eerst. Plaats de n eedle een paar millimeter lateraal van de incisie, en zorg ervoor dat doorheen de fascia laag. Hechtingen alleen via de spier kan scheuren van het weefsel en komen los. Gebruik een tang om de naald van beneden aan de andere kant van de incisie. Vrijlating en de naald opnieuw greep uit buiten het lichaam en trek de hechtdraad door tot enkele centimeters of zo van de staart blijft, zorg ervoor dat u trek het helemaal door.
12. Sluit de wond met een eenvoudige onderbroken patroon van hechten. We maken gebruik van een basisbesluit band met vierkante knopen chirurg (rif knopen) te maken. Loop het lange einde van de hechting rond de naald houder, pak de staart en trek hem door de lus naar u toe en draai. Lus en haal deze door opnieuw, dit keer trek de naald houder van u af. Een derde worp kan gebruikt worden voor extra beveiliging (in dezelfde richting als de eerste). Trim de hechting, waardoor korte staart en doen nog een hechting in de spier een paar millimeter verwijderd. Twee hechtingen voldoende zijn voor kleine hechtingen, drie voor de grotere. Herhaal dit voor de huidlaag. Video demonstraties van de fundamentele hechten techniek zijn te vinden op YouTube - zoek naar "instrument gelijkspel", er zijn heel wat om uit te kiezen, hoewel de basistechniek is hetzelfde.
13. Spoel de vrouw met gedeïoniseerd water en zet haar in een herstel emmer gevuld met koel (18 ° C) water. Terwijl in het laboratorium, zijn de kikkers gehouden in leidingwater behandeld met Amquel aan chlooramines te verwijderen. Om de paar minuten, til de kikker uit het water en zoek slurpend of eye-uitpuilende bewegingen, indicatief voor herstel van de anesthesie.
14. Let op: Survival chirurgie is niet strikt noodzakelijk is om eierstok weefsel te verkrijgen, maar de vrouwtjes blijven een goede eicellen te produceren na een aantal operaties. Het uitvoeren van een operatie te overleven zal ook bezuinigen op het aantal gebruikte dieren. Zorg ervoor dat uw dier care-afdeling van de richtsnoeren te volgen op gewervelde overleven een operatie methoden, post-op zorg en monitoring en voor het aantal toegestane operaties op een individu.

2. Kweken en Defolliculating Eicellen

1. Direct na de operatie is voltooid, verdelen de eierstokken in kleine stukjes (~ 2 cm ²⁾ en op te slaan in verse OCM, met behulp van 5-6 stuks per 90 mm ​​schaal. Individuele lobben van eierstok worden opengesneden, plat uit en snijd ze in vierkante stukjes. Deze worden gespoeld met schoon OCM en geplaatst in gerechten voor cultuur. Afvlakken en verdeling van de eierstok breidt haar leven in de cultuur en maken defolliculation gemakkelijker te maken.
2. Verplaats een kwab voor een kleine schotel van OCM en handmatig defolliculate 300-500 eicellen. Transfer eicellen met behulp van een steriele, brand-gepolijst pipet. We hebben gevonden dat het gebruik van de katoen-plugged soort is van essentieel belang voor het minimaliseren van verontreiniging van de culturen. Bewaar de eicellen bij 18 ° C in 8 ml OCM (in medium gerechten (Falcon 1007)), in groepen van 100-150. Met de praktijk, moet u in staat om voldoende eicellen defolliculate in 1-2 uur. Collagenased eicellen zijn niet geschikt voor gastheer overbrengen omdat ze niet worden fertilizable.
3. Defolliculating methode. We defolliculate gebruik van horlogemakers pincet (Dumont # 4-en of # 5s, Fijn Science Tools), naar aanleiding van de basismethoden beschreven in Smith et al.., (1991). Met behulp van een pincet (in je dominante hand), pakt de theca bindweefsel laag rond een volwassen stadium VI eicel in de buurt waar de follikel is bevestigd aan de eierstok (de steel). Met de andere pincet, pak de eierstok grenzend aan het eerste paar. Licht openscheuren van de follikel laag door te trekken over de eicel. Voorzichtig plagen de eicel uit het weefsel. Succes defolliculated eicellen zijn floppier dan eicellen gewoon getrokken zonder het verwijderen van de follikel laag en zal zijn verstoken van zichtbare bloedvaten.
4. Opmerking: Het is essentieel om een ​​zeer lichte druk te houden op de uiteinden van de tang, nauwelijks genoeg voor de tips te ontmoeten. Grip te strak is een veel voor bij beginners en zal resulteren in de eicel wordt getrokken weg met de follikel intact. Exclusief voor zichzelf houden een goede tang voor defolliculating. De tips dienen nauwkeurig te voldoen en moet iets botter dan de tang voor het maken van explantaten van Xenopus-embryo's (figuur 1).
5. We routinematig testen volwassen ongeveer 20 met progesteron en afbreken van het experiment als de rijping tarief is slecht (<50% na 6-7 uur bij kamertemperatuur).
6. Op dit punt kunnen de eicellen worden gemanipuleerd en gekweekt als gewenst is, zoals micro-injectie van oligo, morfolino of mRNA. Injectie procedures verschillen per lab, dus zullen we hier niet beschrijven deze. Eicellen kan worden gehandhaafd tot een week in de OCM, maar over het algemeen de gezondheid afneemt dus het is best om ze te gebruiken voor een transfer binnen 96 uur van isolatie.
7. Houd in gedachten dat slechts vijf tot zes groepen (waaronder een controle) kan worden overgedragen aan een enkele vrouw als gevolg, de beperkingen op vitale kleurstoffen, dus plan je experimenten.

"> 3. Eicel Rijping en stimulering van de Prospectieve Host Vrouwen

1. Als het uitvoeren van een redding van oligo uitputting, Injecteer de mRNA (meestal 50 tot 300 pg RNA) ~ 24-48 uur na de oligo. De oligo's zal hebben aangetast door deze tijd en mag geen invloed op de ingespoten RNA.
2. Op de avond voorafgaand aan de overdracht, voeg 16 ul van progesteron werkoplossing (1 mM in EtOH) om eicellen in 8 ml OCM in medium gerechten (laatste progesteron concentratie ~ 2 uM). Incubeer 10-12 uur bij 18 ° C, zodat voor de eicel rijping.
3. Injecteer 3-5 vrouwtjes met 1000 eenheden per kikker van hCG voor ei leggen induceren. Onze experimenten lijken beter te werken als eicel rijping en de hCG injectie worden gedaan rond dezelfde tijd, ongeveer 12 uur voorafgaand aan implantatie in de gastheer (bv. tweeëntwintig -10 AM). Laat vrouwtjes bij RT of 18 ° C gedurende de nacht.

4. Voorbereiding en Vital Dye kleuring van Eicellen

1. Op de ochtend van de transfer, zodat ~ 45-60 'op te zetten en de procedure uit te voeren. Op dit punt kan rijpe eicellen worden ingevroren voor latere analyse van de effectiviteit van mRNA knockdown of eiwit expressie. Controleer ook of de eicellen niet besmet zijn geworden en dat er een goede rijping snelheid (> 50%). Geïnfecteerde eicellen niet bevruchten. Dooi vitale kleurstoffen (stoffen) en spin bij max. snelheid gedurende 5 minuten.
2. Kleur de verschillende experimentele groepen door het toevoegen van 80 pi van de juiste vitale kleurstof (s) om de eicel gerechten en incubeer met rockende voor 15 '. Gedurende deze tijd, selecteert u een gastheer vrouwelijke en beginnen anesthesie. Kies een kikker die langzaam is eieren leggen normaal of een die overvloedig eieren met milde knijpen produceert. Eieren van de host moet van goede kwaliteit. Voorkomen dat vrouwen die strings leggen van de eieren of gemalen eieren.
3. Breng de gekleurde eieren op een grote schotel van verse OCM, swirl kort te wassen en leg ze opzij vóór de overdracht.
4. Bereid een steriele Pasteur pipet met een boring net breed genoeg om een ​​eicel (~ 1.5 mm) voor gebruik in het transplanteren van de eicellen tegemoet te komen. De score van de pipet met een diamant potlood en breken netjes. Brand polijsten totdat de randen zijn glad, zorg niet te smelten de opening dicht.

5. Het uitvoeren van de eicel Transplantatie

1. Eicel transplantatie gebruikt dezelfde chirurgische procedures zoals beschreven in deel I, maar in plaats van het verwijderen van eierstokken, oöcyten gemanipuleerd worden geïntroduceerd in de lichaamsholte met een pipet. Idealiter zou de transfer procedure zo snel worden uitgevoerd als mogelijk is en de grootte van de incisie moet zo klein mogelijk zijn.
2. Anesthesize de host vrouwelijke en voor te bereiden chirurgische instrumenten zoals beschreven in deel I. Zorg en insnijding zoals beschreven in deel I. De incisie kan kleiner zijn, maar moet groot genoeg zijn om de boring van de overdracht pipet (figuur 2A) passen.
3. Te verplanten van de eicellen, grijpen en een flap van spier-en bindweefsel verhogen met een pincet en de invoering van de experimentele eicellen met behulp van het Pasteur pipet hierboven bereide. Swirl de schotel van eicellen om ze te verzamelen in het centrum en zuigen zo veel als mogelijk. Laat de eicellen zich te vestigen in het uiteinde van de pipet om overtollige vloeistof te voorkomen worden geïntroduceerd en steek de punt van de pipet in de incisie en langzaam laat de eicellen te sijpelen in de lichaamsholte (Figuur 2B). Herhaal dit totdat alle eicellen zijn overgedragen. Niet los van de spierlaag op elk gewenst moment, totdat je begonnen hechten, of de eicellen zal uit morsen van de incisie.
4. Zodra de eicellen zijn overgedragen, pak beide zijden van de incisie met een tang en breng ze samen, waardoor de eicellen zich te vestigen in het lichaam holte. Begin hechten, zoals beschreven, en zorg ervoor dat de spanning omhoog te houden op de spier-en fascia tot de eerste knoop is verbonden (figuur 2C). Dit zorgt ervoor dat de eicellen uit worden verdreven uit en zal de randen van de incisie gelijkmatig te genezen. Voeg nog een hechting in de spier / fascie laag en vervolgens hechtdraad de huid.
5. Spoel de vrouw met gedeïoniseerd water en zet haar in een herstel emmer gevuld met gekoeld (18 ° C) Amquel behandelde water. Monitor haar herstel van de verdoving, zoals hierboven. Ze moeten beginnen eitjes te leggen normaal gesproken na de operatie.
6. Verkrijgen testes van een mannelijke kikker met de normale procedures. Bewaar de testes in de OCM of L15 totdat het nodig is. Wij geven de voorkeur verse testis bij het bemesten van overdracht van experimenten.

6. Herstel van Eicellen en in vitro fertilisatie

1. Peritoneale cilia rijdt de overgedragen eieren (en normale coelomic eieren van de gastheer) naar de openingen van de eileiders in de voorste van de lichaamsholte. Gekleurde eieren kunnen worden hersteld vanaf 2-3 uur na de overdracht door normale knijpen. Eieren kunnen worden verkregen elk half uur of zo totdat het vrouwtje niet meer leggen.
2. Bemesten in een sperm vering (in ~ 4 ml 1x MMR) gedurende 4 minuten. Flood en spoel uitgebreid met 0.1x MMR. Eieren moeten normaal te activeren en zal beginnen te klieven ~ 1.5 tot 2 uur na de bevruchting. Overgedragen eieren zullen vaak klieven iets later dan de gastheer eieren.
3. Verwijder de gelei jassen met cysteïne als normaal en sorteren embryo's in verschillende gerechten. Dit kan gedaan worden op elk moment, afhankelijk van de behoeften van het experiment. Meestal makkelijkst om de verschillende kleuren rond de 4-cellig stadium en moeilijkste tijdens de late blastula stadium te identificeren. Cultuur de eieren op een lage dichtheid (<50 per medium schaal) in schone 0.1x MMR. Vanaf dit punt kan embryo's worden behandeld en normaal gemanipuleerd.
4. Breng de kikkers om het dier faciliteit en monitor voor complicaties in de komende paar dagen.
5. Alternatieve methode bevruchting, leg in een hoog zout buffer
   1. Nadat de kikker is hersteld van anesthesie, zet haar in 1L ~ high-zout MMR (1.2x). Laat het vrouwtje om eieren te leggen in de buffer voor ongeveer 4-6 uur. Knijp de resterende eieren uit, afvoer 1,2 x BMR en gekleurde eieren in schoon schaal sorteren, verwijder alle mogelijke vloeistof.
   2. Was uitgebreid met 0.3x BMR en bemesten in een minimale volume van 0.3x MMR / sperma schorsing tot de eieren te activeren (10 minuten). Flood met 0.1x BMR en cultuur, zoals hierboven. Deze optie is handig als er veel eieren nodig zijn op het hetzelfde stadium of als manuele expressie van eieren schadelijk voor de donor eicellen.

Discussie

Een succesvolle overdracht zal leiden tot een bevruchting en normale splitsing van> 50% van de eicellen (figuur 3). Over het algemeen tussen de 30-60% van de overgedragen eicellen zal overleven langs de neurula fasen. We dragen doorgaans 75 tot 150 eicellen per experimentele groep, die voldoende embryo's zal opleveren voor verschillende soorten analyses (in situ, RT-PCR) en het visualiseren van het fenotype. Implanteren van aanzienlijk meer eicellen lijkt niet sterk te verhogen de opbrengst. Ook moet minstens 30 ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
70% Leibovitz's L-15 medium (met L-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml Bovine serum albumine (BSA, fractie V)	(Sigma A-9418-50g)
1x penicilline-streptomycine	(Sigma P-0781)
Aan te passen aan de pH 7,6-7,8 met 5N NaOH
Het maken van verse wekelijks, bewaren bij 18 ° C.

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl 2

10 mM MgCl 2

150 mM HEPES

aan te passen aan de pH 7,6-7,8

Bewaren bij 4 ° C

1 g / L 3-aminobenzoëzuur Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
0,7 g / L natriumbicarbonaat
Los op in Amquel behandelde water
Het maken van verse wekelijks

10 mM Progesteron (Sigma P-0130) in 100% ethanol

Vul aan tot 1 mM in 100% EtOH voor een 500x voorraad / werkende oplossing

Bewaren bij -20 ° C

Blauw: 0,1% Nijl Blue A	(Aldrich 121479-5G),
Rood: 0,25% neutraal rood	(Sigma N-6634),
Bruin: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Groen (80 pl blauw + 80 ui bruin),
Mauve (80 pl blauw + 80 pl rood).
Een zesde kleur, Orange (80 ul rood + 80 ui bruin), kan ook gebruikt worden, maar is vaak moeilijk te onderscheiden van bruin.