Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo's en montage van een Celadhesie Assay

Samenvatting

Deze video toont de techniek die gebruikt wordt voor de voorbereiding van organisator en dier pole explantaten van Xenopus laevis embryo's, waaronder het gebruik van de wenkbrauw mes - een speciale tool gemaakt dissectie van je wenkbrauw. Het protocol voor het monteren van een adhesie-test wordt ook gegeven, die probes voor de aanwezigheid van belangrijke adhesiemoleculen op het oppervlak aanwezig organisator of dierlijke paal cellen die essentieel zijn voor een goede ontwikkeling.

Protocol

Voorbereiden Hechting Chambers (de dag vóór de injectie / dissectie)

Hechting Assay Chambers

Als u een conventionele samengestelde microscoop (optische lokaliseert boven het podium), is het ncecessary om een ​​lage hoogte hechting kamer als volgt. Bij gebruik van de omgekeerde-optiek microscoop, dan "NUNC Lab-Tek Chambered dekglaasje" kan gewoon worden gebruikt, en sla de stappen # 1 - 2.

1. Bevestig een van de "pers-to-seal silicium isolator" op een 40 x 24 mm dekglas. Druk stevig op de isolator om de dekglas op schone werkblad en zie van de andere kant om ervoor te zorgen dat de isolator geheel is bevestigd zonder luchtbellen.
   
   
2. Optioneel: Doe de hechting kamers in een glazen petrischaal met een Whatman filter papier en autoclaaf in droge-cyclus te steriliseren. Cool hen naar RT.

Coaten van de Kamer

1. Doe een 200ml druppel van de werkoplossing van cadherine (10mg/ml) of met fibronectine (20mg/ml) op het midden van een autoclaaf hechting kamer, met behulp van sigmacoated geel tips. Incubeer bij RT gedurende 4 uur.
   
   
2. Haal de cadherine of met fibronectine oplossing en transfer naar een 1,5 ml buis. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor de komende twee weken.
   
   
3. Doseer 500 ml van 4% BSA in 1x MBS-H naar de kamer te blokkeren. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
   
   
4. Zuig het BSA-oplossing. Was de kamer met 500ml 1x MBS-H twee keer. Na de tweede wasbeurt, zuigen de meeste van de MBS-H (niet volledig), en op te slaan in een gesloten verpakking bij 4 º C. Deze hechting kamer is goed voor de komende 2 - 3 dagen.

Dissectie en dissociatie van Animal Cap Explantaten

1. Incubeer de geïnjecteerde embryo's in 0.1x MBS-H, verdund van de geautoclaveerde 1x MBS-H, als niet-geautoclaveerde medium ergens draagt ​​weinig kiemen die kunnen verstoren de gedissocieerde dier dop cellen.
   
   
2. Maak 1x Barth's agarose platen en CMF-MBS agarose platen met 60mm gerechten, minstens evenveel als het aantal van uw monsters. Giet geautoclaveerd 1x MBS-H in 1x Barth's platen. Voor de CMF-MBS borden, giet er 10 ml van de CMF-MBS.
   
   
3. Als de embryo's worden stadium 8,5, start het ontleden van het dier caps in de plaat een 1x Barth's. 10 tot 15 explantaten per monsters zijn meestal genoeg voor een experiment.
   
   
4. Breng het dier dop explantaten naar een CMF-MBS plaat. Incubeer de explantaten voor 45 - 60 minuten tot de explantaten zijn volledig gescheiden. Gentle gemoedsbewegingen in om de 15 minuten zal helpen de dissociatie.

Celadhesie Assay

1. Zaaien van de cellen: Doseer 500ml 1x MBS-H om de hechting kamer bereid in de stappen in de bovenstaande punten, Adhesie Assay Chambers en Coating de Kamer. Breng de gedissocieerde dier dop cellen van de CMF-MBS plaat om de hechting kamer met behulp van P200 met een sigmacoated en gehakte-off geel tips.
   
   
2. Optioneel: Indien mogelijk, voorzichtig zuigen het medium tot ongeveer 2 / 3 tot de helft, zonder bloot cellen aan de lucht. Voeg ongeveer dezelfde hoeveelheid verse MBS-H, om ervoor te zorgen dat het medium voldoende Ca ^{2 +} bevat en Mg ^{2 +.}
   
   
3. Incubeer bij RT voor 45 - 90 minuten. Kijk dus regelmatig op de cellen te zien of ze zijn verbonden aan de onderkant.
   
   
4. Nu kunt u het beeld van de cellen onder een microscoop.
   
   
5. Zet de hechting kamer op een rooster slide glas. Breng een van de hoeken van de hechting kamer naar een hoek van het raster dia. Tel en noteer het nummer van het bijgevoegde cellen in verschillende netten.
   
   
6. Giet 1L van MBS-H in een grote plastic emmer (bijv. Tupperware, etc.). Voorzichtig de hechting slide kamer te maken aan de bodem van de emmer. Draai het op de orbitale schudder gedurende vijf minuten bij lage snelheid (50 - 60rpm).
   
   
7. Leg de hechting kamer op de grid schuift, het afstemmen van de dezelfde hoek van de kamer naar dezelfde hoek van het raster glijbaan, zoals werd gedaan in stap # 5 van deze sectie, Celadhesie Assay. Tel het aantal cellen die verbonden blijven op hetzelfde rooster die je hebt geteld voordat het wasgoed. Bereken het percentage van cellen die bevestigd blijft na het wassen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x MBS-H	Buffer			Gemodificeerd Barth’s medium: recept voor 1 L: 5,14 g NaCl 5 mg KCl 0,2 g NaHCO3 0,2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, vrij zuur. Stel de pH bij naar 7,4 met NaOH. Autoclaveren.
CMF-MBS	Buffer			Dit is de Ca2+/Mg2+-vrije versie van MBS-H. Recept voor 500 mL: 2,57 g NaCl 37,5 mg KCl 0,1 g NaHCO3/sub> 1,19 g HEPES, vrij zuur. Stel de pH bij naar 7,4 met NaOH. Autoclaveren.
1% agarose/1x Barth’s platen				evenveel als het aantal monsters
1% agarose/CMF-MBS platen				evenveel als het aantal monsters
E-cadherine/Fc-chimeer	Reagens	Sigma-Aldrich	E-2278	Los 0,1 mg vaste E-cadherine op in 100 µL 1x MBS-H met 40% glycerol om een 100x masterstock (1,0 mg/mL) te maken. Bewaren bij –20 °C. Maak vlak voor gebruik een 1/100 verdunning met 1x MBS-H om een werkoplossing van 10 µg/mL te verkrijgen. Er is 200 µL van deze werkoplossing per monster nodig.
Fibronectine, 0,1% oplossing	Reagens	Sigma-Aldrich	F-1141	Deze kant-en-klare oplossing kan als 50x stock worden gebruikt. Maak vlak voor gebruik een 1/50 verdunning met 1x MBS-H om een werkoplossing van 20 μg/mL te verkrijgen. Er is 200 μL van deze werkoplossing per monster nodig. Ik raad het gebruik van vaste fibronectine NIET aan, omdat dit moeilijk op te lossen is bij een concentratie van 0,1% voor het maken van de stockoplossing. Hoewel deze kant-en-klare 0,1% oplossing duurder is, is deze beter voor het verkrijgen van consistente resultaten.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fractie V
Sigmacoted gele tips	Instrument
Nr. 1 dekglasjes				40 mm x 24 mm of 60 mm x 24 mm
Press-to-seal siliconen isolator	Instrument	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2,5 mm diepte x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Instrument	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid-objectglas	Instrument			of Finder-reticule voor celtelling