Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters

Samenvatting

We zien een donker veld microscopie op basis van Gabor-achtige filter om subcellulaire dynamiek maatregel binnen enkele levende cellen. De techniek is gevoelig voor veranderingen in de structuur van de organellen, zoals mitochondriën fragmentatie.

Samenvatting

Demonstreren we een instrument dat microscopisch kleine subcellulaire structuur die voortvloeien uit organel morfologie en de organisatie binnen onbesmet levende cellen kunnen meten. Het voorgestelde instrument breidt de gevoeligheid van de label-free optische microscopie op nanoschaal veranderingen in organel grootte en vorm en kan gebruikt worden om de studie van de structuur-functie relatie met betrekking tot organel dynamiek onderliggende fundamentele biologische processen, zoals de geprogrammeerde celdood of cellulaire versnellen differentiatie. De microscoop kan eenvoudig worden toegepast op de bestaande microscopie platforms, en kan dus worden verspreid aan de individuele laboratoria, waar wetenschappers kunnen implementeren en het gebruik maken van de voorgestelde methoden met onbeperkte toegang.

De voorgestelde techniek is in staat om subcellulaire structuur karakteriseren door het observeren van de cel door middel van twee-dimensionale optische Gabor filters. Deze filters kunnen worden afgestemd op gevoel met nanoschaal (10 van nm) gevoeligheid, specifieke morfologische kenmerken met betrekking tot de grootte en oriëntatie van niet-sferische subcellulaire organellen. Terwijl op basis van contrast gegenereerd door elastische verstrooiing, is de techniek niet op een gedetailleerd inverse verstrooiing model of op de Mie theorie morfometrische metingen te extraheren. Deze techniek is dus van toepassing op niet-bolvormige organellen die een nauwkeurige theoretische beschrijving scatter niet gemakkelijk gegeven, en biedt onderscheidende morfometrische parameters die kunnen worden verkregen binnen onbesmet levende cellen om hun functie te beoordelen. De techniek is voordelig in vergelijking met digitale beeldverwerking in die zin dat direct werkt op het veld van het object te transformeren in plaats van de intensiteit van de gediscretiseerde object. Het is niet afhankelijk van hoge beeld-sampling rates en kan dus worden gebruikt om de morfologische activity snel scherm binnen honderden cellen in een tijd, dus sterk de studie van de structuur organel vergemakkelijken dan individuele organel segmentatie en wederopbouw met behulp van fluorescentie confocale microscopie van de sterk vergrote digitale beelden van beperkte gezichtsveld.

In deze demonstratie laten we de gegevens van een mariene diatomeeën de methodiek illustreren. We laten ook zien voorlopige gegevens verzameld van levende cellen om een ​​idee van hoe de methode kan worden toegepast in een relevante biologische context te geven.

Protocol

1. Aan de cellen klaar

1. De cellen die werden uitgeplaat op de dag voor moeten worden gemerkt met Mitotracker groen voor fluorescentie beeldvorming van de mitochondriën.
2. Verwijder de 100 uM stockoplossing van Mitotracker groen in DMSO eerder gemaakte uit de 4 ° C vriezer, en op kamertemperatuur met de hand. Neem ook uit runderen aorta endotheelcellen (BAEC) celkweekmedium ook eerder bereid en warm tot 37 ° C in de stationaire waterbad.
3. Zodra de Mitotracker en de cultuur medium worden opgewarmd, plaats deze in de motorkap en zorg dat uw handschoenen en alle buitenkant van de containers met 70% ethanol-oplossing te steriliseren. Draai niet op de motorkap licht, zoals de fluorescent label is lichtgevoelig en zal snel photobleach in de omgevingslucht kamer licht.
4. Het maken van de juiste concentratie voor de mitochondriale etikettering is erg belangrijk. Te weinig is niet het etiket van de mitochondriën effectief, terwijl te veel Mitotracker kan hebben toxische effecten. Een concentratie van 100 nM van Mitotracker geïncubeerd gedurende 45 minuten met de cellen werkt goed. Bereid deze concentratie door de toevoeging van 100 ul van Mitotracker voorraad 10 ml kweekmedium in een 15 ml buis. Dit zal genoeg voor minstens een experiment.
5. Vervang de bestaande medium met de gelabelde medium door te zuigen uit de oude medium met een Pasteur pipet is aangesloten op de vacuüm-lijn. Dan onmiddellijk voeg 2 ml van de gelabelde medium om elke bezette cultuur goed in de 6 wells plaat.
6. Omdat de fluorescent label is gevoelig voor licht, de cellen snel vervangen in de incubator zonder bloot aan direct licht wordt. Met betrekking tot de 6 wells plaat met de handen werkt goed voor. De cellen zullen blijven in de incubator gedurende 45 minuten.

2. Haal het optische opstelling klaar

1. Terwijl de cellen wachten in de couveuse, moeten we inschakelen van de optische opstelling. In de optiek kamer, zet u eerst het kwik booglamp, gevolgd door de computer, de microscoop, de camera's, en de laser. Steek de stekker in het digitale microspiegeltjes (DMD) en de draaiende diffuser.
2. Controleer of dat de optische lancering in lijn is door te kijken door de microscoop oculair om ervoor te zorgen dat het gezichtsveld fel wordt verlicht door het laserlicht.
3. Reinig het doel door het vouwen van een stuk van de lens papier in een strak vierkant en grijpen strak met een hemostat. Dompel de lens papier in ammoniak-vrij glas schoonmaken oplossing om een ​​kleine hoeveelheid te absorberen in het papier. Rap van de hemostaat op uw vrije hand een paar keer overtollige te verwijderen. Veeg de doelstelling door stevig toepassing van een schoon, continue vegen over het doel van het ene eind naar het andere, gaande over de lens in het midden. Niet opnieuw vegen of schrobben. Gooi gebruikte papier.
4. Voor het laden van het monster, plaatst u de graticulezone over de 63x olie-immersie objectief door het droppen van 1-2 kleine druppels immersie olie over het doel, terwijl het doel is helemaal naar beneden. Plaats dan de streepplaat in het podium. Verhoog dan de doelstelling, zodat de olie "pakt" het monster. Focus het monster in het oculair.
5. Voor het uitlijnen van de condensor, past u de condensor hoogte, zodat het op een lijn in het centrum van Kohler verlichting door zich te richten de zeshoekige rand van de condensor veld te stoppen. Het centrum van de condensor veld stuk over het gezichtsveld, indien nodig door aan de condensor centrering draaiknoppen. De condensor diafragma stop moet worden gesloten.
6. Start het programma en IPlab input van de instellingen naar de RoperScientific Cascade 512 camera te bedienen. Bevestig dat de camera is ingesteld op transfer mode frame. Start de live preview door het uitvoeren van de "Acquire focus" commando. Stel de index prefix en file locatie waar de beelden worden opgeslagen.
7. Start het programma en RSImage input van de instellingen naar de CoolSNAP programma te bedienen. Klokken-modus moet worden ingesteld op normaal.
8. Start de DMD-software en plaats de donkere veld iris aan het script menu, gevolgd door de "Load en Reset" commando en voer het script.
9. Stuur het licht naar de DMD en Cascade 512 camera door het instellen van de microscoop optovar en viewport naar LSM. Deze stuurt het beeld door de DMD en de aangepaste optica, projecteren de DF beeld op de CCD. De donkere veld (DF) beeld zou moeten verschijnen op de live preview reeds aan de gang in IPlab. Stel het scherpstellen van de microscoop, indien nodig om het beeld scherp op de live preview.
10. Neem een ​​snapshot van het gezichtsveld met behulp van de "single te verwerven" commando. Stel de belichtingstijd hoog genoeg is om minstens 10.000 graven van het signaal in het beeld zorgen. Na de overname, gebruik de "opslaan als geïndexeerd" commando om de afbeelding op te slaan op schijf. Dit beeld van de graticulezone meet de grootte van het gezichtsveld (FOV).
11. Nu, verplaatst u de graticulezone monster, zodat de graticulezone is buiten de FOV, zodat alleen achtergrond zichtbaar is. Het verwerven van een achtergrond afbeelding van het veld op eenlang genoeg belichtingstijd om ervoor te zorgen dat ten minste 5.000 graven van het signaal wordt verkregen. Dit beeld zal hulp op de achtergrond aftrekken van de ongefilterde beelden.

3. Het laden van de filterbank en het gebruik van de setup om gefilterde-achtergrond beelden te verwerven

1. Nu moeten we Gabor-gefilterde beelden van de achtergrond te verwerven. Laad de Gabor filter bank script om de DMD besturingssoftware. Voer het hele script om de filters buffer om de onboard geheugen van de DMD, dit kan enkele minuten duren.
2. Zodra de gehele script wordt gebufferd, kunnen we nu krijgen gefilterd beelden van de achtergrond. Gebruik maken van de start en stop markers in het DMD-software op de DMD opdracht te geven slechts een set filters die overeenkomt met een Gabor-achtige filter in een tijd last, en voer het script. Het live-beeld voorbeeld zou moeten veranderen van donker veld naar de gefilterde afbeelding voor deze filter.
3. Open de overname script in IPlab van de schijf. Pas de belichtingstijd om ervoor te zorgen dat ten minste 2.000 graven van het signaal worden overgenomen. Omdat de DMD script wordt uitgevoerd, te annuleren de live preview in IPlab en voer de overname script. Dit zal automatisch verwerven, index en sla het gefilterde afbeelding op de harde schijf.
4. Zodra het eerste beeld wordt verkregen, stop het script uitgevoerd in de DMD-software en verwijder de gebruikte commando's van het script. Vervang de start en stop markers aan het begin en einde van het volgende filter in te stellen. Herhaal de acquisitie in IPlab.
5. Herhaal stap 3.4 tot de hele filterbank is gebruikt en alle gefilterde beelden zijn aangekocht en opgeslagen.

4. Plating de cellen

1. Inmiddels zullen de cellen snel klaar om te plaat voor het experiment. Steek de stekker in de soldeerbout op het lab benchtop. Verwijder de L15 het bekijken van medium en warmte tot 37 ° C. Maak een werkstation met een papieren handdoek en een Kimwipe. Maak een aantal wieken door de scheuren en twirling Kimwipes. De wieken zal helpen bij de overdracht van vocht naar en van de cel plaat.
2. Na deze, moeten we het bord van de steekproef. We maken gebruik van de bewerkte metalen monster houders to plate onze cellen, het maken van een "dekglaasje sandwich" met de metalen plaat tussen. Breng een dun rups van vacuüm vet uit een injectiespuit rond de bovenste rand van de metalen plaat gat te breiden ongeveer halverwege aan de uiteinden van de groeven aan elke kant. Druk voorzichtig een schone nee. Een dekglaasje op het vet. Draai de plaat over en vet rond het gat. Schakel verlichting in de kamer.
3. Nu krijgen we de cellen uit de couveuse, het hanteren van de incubator inhoud met nitril handschoenen examen gesteriliseerd met 70% ethanol. Verwijder de cel plaat uit de incubator, houd je adem in terwijl de incubator deur open. Wees voorzichtig om de blootstelling aan het licht zaal te minimaliseren.
4. Verwijder de dekglaasje die zullen worden gebruikt voor het experiment van de zes-well plaat, merkt op dat de kant die face-up was in de put is de kant met cellen bevestigd. Voorzichtig droog het dekglaasje aan beide kanten tot het bijna helemaal droog is, terwijl het bijhouden van welke kant van het dekglaasje heeft de cellen. Vervolgens naar beneden op de dekglaasje, cel kant, in de ingevette metalen plaat over het gat kijken, om ervoor te zorgen dat er geen lucht gaten blijven binnen het vet laag. Het vet moet vormen een waterdichte afdichting zodat voor ons om de cellen te laden met de L15 medium. Zodra u zeker bent van deze, back flip de plaat over.
5. Pipetteer de L15 medium in de geïllustreerde cellen door het forceren van de vloeistof door de gleuf tussen de bovenste dekglaasje en de metalen plaat. Pipetteren 200 pi op een moment werkt goed. Het eerste deel pipet moet vullen de ruimte ingeklemd tussen de dekglaasjes met de vloeistof de uitbreiding bijna tot aan de groef aan de andere kant.
6. Pipetteer nog eens 200 ul medium in de vergulde cellen, maar deze keer, een lont houden op het verzetten tegen grove, zodat het medium stroomt van de ene kant naar de andere. Dit wast de cellen en verwijdert alle sporen van het oude medium. Wees voorzichtig om eventuele luchtbellen te voorkomen dat de vorming van in de vloeistof tijdens deze stap. Herhaal dit proces 2-3 keer met een nieuwe lont voor elke spoeling.
7. Denk aan de soldeerbout we aangesloten? Nu is de tijd dat het went. Flip de plaat op zijn kop eens te meer, het ondersteunen van de plaat uit de randen zodat vloeistof wordt opgesloten in de cel reservoir en kan niet druppelen naar beneden. Dompel de soldeerbout in de valap beker. Dit zal snel smelt een deel van de valap die dan vast aan de soldeerbout tip. Voorzichtig toe te passen gesmolten valap rond de randen van de onderste dekglaasje (die nu naar boven) met de soldeerbout tip als een applicator. Ga verder dompelen en van toepassing tot een ga je helemaal rond de perimeter dekglaasje, het afdichten van de dekglaasje op de metalen plaat.
8. De onderste dekglaasje heeft cellen die groeien op, en kan residu van de opgedroogde medium op de blootgestelde zijde te hebben. Reinig alle residuen van het dekglaasje oppervlak door Balling een Kimwipe en Cleaning de dekglaasje in een glijdende beweging net als het reinigen van de doelstelling. Dit zorgt ervoor dat het dekglaasje wordt schoonste in het centrum waar het zal worden bekeken.
9. Haal de stekker van de soldeerbout en de terugkeer van de 6-wells plaat aan de incubator het observeren van de dezelfde insluiting en steriliteit procedures. Neem de vergulde cellen om de optiek lab en op het doel, zoals beschreven in de stappen 2.4 en 2.5.

5. Het uitvoeren van het experiment

1. Zoek een mooi gebied van gezond uitziende cellen.
2. Het verwerven van een donker veld beeld van het gezichtsveld. Lijn de microscoop in differentieel interferentie contrast (DIC) en het verwerven van een DIC beeld. Zorg ervoor dat de blootstelling tijden zijn lang genoeg om ervoor te zorgen dat signaal adequaat is.
3. Nu moeten we de fluorescerende beelden op de andere camera te verwerven. Om DIC afbeeldingen op de CoolSNAP maken wij gebruik van een blauwe LED aan de condensor, vervangen en verwijderen als dat nodig is. Terwijl de microscoop is nog steeds uitgelijnd in DIC, Stuur het licht naar de CoolSNAP door het instellen van de microscoop optovar om 1.0x en viewport tot 100% verrekijker. Doorschakelen het beeld van het oculair naar de camera. Plaats de LED over de condensor om het veld te verlichten en een voorbeeld van de FOV in RSimage en stel scherpstellen indien nodig. Het verwerven van een DIC afbeelding en opslaan op schijf. Merk op hoe de FOV is verschillend van de een verkregen uit de Cascade camera. Deze beelden zullen moeten worden geregistreerd tijdens de analyse fase na het experiment.
4. Verkrijgen van een fluorescentie beeld door het aanpassen van de filter kubus aan de fluoresceïne filtercube. Verwerven van een afbeelding door kort te draaien op de fluorescentie excitatie met behulp van de microscoop en draai hem dan uit zodra de overname is afgerond. Omdat we ons gericht het monster in DIC, is de fluorescentie beeld en scherp. Dit bespaart op de belichtingstijd in fluorescentie, waardoor vertragen fotobleken. Sla de fluorescentie afbeelding op de harde schijf.
5. Nu moeten we de gefilterde beelden te verwerven. Stel de microscoop te donker veld en verzend het licht door de LSM-poort als in 2.9.
6. Voer het hele Gabor filterbank script als in 3,3-3,5. We hebben nu klaar met de data-acquisitie voor een tijdstip.

6. Overschakelen op de middellange tot de cellen bloot te stellen aan staurosporine (STS), en onderhouden van het medium gedurende het experiment

1. Terwijl de cellen zijn nog steeds op het podium en zonder de gebied van het uitzicht, schakelaar uit de reguliere L-15-medium voor hetzelfde met een 1 uM oplossing van STS gemaakt van een 4 mM voorraadoplossing van STS in DMSO. Gebruik de wicking methode beschreven in de stappen 4.6 aan de media te schakelen.
2. Nu, we herhalen de stappen 5,2-5,6 voor latere tijdstippen. We herhalen dit proces tot het experiment is voltooid.
3. In de loop van het experiment, zal meer medium moeten worden toegevoegd, zodat het monster niet uitdrogen. Dit wordt bereikt door pipetteren medium in de groef van de cel plaat zonder het verwijderen van het podium en zonder verstoring van de FOV.

7. Representatieve resultaten

Aan het einde van het experiment, zullen de verzamelde gegevens omvatten een groot aantal van gefilterde beelden die moeten worden verwerkt om de subcellulaire structurele gegevens op te halen. Twee voorbeelden worden getoond voor een optisch filter bank bestaande uit 9 Gabor-achtige filters met filter = periode S 0.95μm, Gaussian envelop standaarddeviatie s = S / 2 = 0.45μm, en oriëntaties Φ = 0 ° tot Φ = 160 ° in 20 ° van elkaar. (Zie ook [1] voor meer details).

Voorbeeld 1: Marine Diatomeeën

We hebben voor het eerst toegepast onze oriëntatie gevoelig filter bank om een ​​marine diatomee monster (Carolina Biologische Supply Company) met gerichte functies die duidelijk zichtbaar in het donker-veld (DF) imaging (afb. 1). De optisch gefilterde beelden worden getoond naast de ongefilterde beeld van het monster voor vergelijking.

Figuur 1: Dark veld (DF) en optisch gefilterde afbeelding van mariene diatomeeën. Analyseren we de diatomee in de rechterbenedenhoek van het beeld (witte pijl in het meest linkse paneel).

De set van negen Gabor-gefilterde beelden van de diatomeeën werden verwerkt pixel-by-pixel voor object oriëntatie en rondheid. Processing bestond uit (1) sommeren gemeten reacties van alle negen Gabor-gefilterd beelden op elke pixel op de totale omvang van het signaal reactie daardoor encoding reactie significance te bepalen, en (2) het vinden van de Gabor filter oriëntatie, Φ, waarbij de respons is gemaximaliseerd en het nemen van de verhouding van deze maximale respons op de gemiddelde respons voor alle hoeken waardoor dat codeert voor de mate waarin de objecten op elke pixel heeft een voorkeursrichting. De mate van oriëntatie is nauw verwant aan de geometrische aspect ratio van het deeltje. In Fig. 2B, the totale respons van de pixel om het filter bank (parameter 1) en de mate van oriëntatie of aspect ratio (parameter 2) worden gecodeerd in de kleurverzadiging en tint, respectievelijk. Een hoogte-breedteverhouding in de buurt van een (blauw) is aanwezig in gebieden waar er geen voorkeur heeft antwoord hoek, terwijl de hogere waarden (rood) geven aan gebieden waar een hogere gewenste kijkhoek respons aanwezig is. Onderbouw deeltje oriëntatie is gecodeerd in een koker perceel (fig. 2C), waar elke regel nauw overleg met de onderliggende lokale objectoriëntatie zichtbaar ongefilterde donker-veld (Fig. 2A).

Figuur 2: A: Dark veld beeld van diatomeeën. B: Object oriëntatie beeld. Kleur schaal geeft de mate van oriëntatie (aspect ratio), terwijl de helderheid codeert voor het belang van de totale Gabor filter reactie. C: Oriëntatie van voorwerpen met het antwoord van intensiteit van ≥ 10% van het maximum. Lijnstuk geeft de overeenkomstige structuur op de lange as.

Voorbeeld 2: apoptotische cellen

Hier laten we gefilterde beelden van runderen endotheliale cellen behandeld met staurosporine (STS), die zijn verwerkt in het op dezelfde manier als de diatomee. Fig. 3 toont een ongefilterde donker-veld (DF) beeld van de cellen, samen met de negen gefilterde beelden op het tijdstip T =- 180 minuten. voorafgaand aan de STS behandeling.

Figuur 3: Dark veld (DF) en optisch gefilterd beelden van een veld met meerdere levende endotheelcellen.

De gefilterde beelden werden vervolgens overgenomen om de 20 minuten voor een periode van drie uur na de STS behandeling. Fig. 4a toont een aspect-ratio kaart van de cellen als een functie van de tijd. In dit geval is de kleur tint geeft de mate van oriëntatie (gelabeld gerichtheid) als voor de kleur tint in Fig. 2b hierboven. Werd echter de beeldverhouding helderheid niet gewogen door de gemiddelde filter reactie. Door het registreren van onze aspect ratio kaarten met fluorescentie beelden van de gelabelde mitochondriën in deze cellen (Fig. 4b), hebben we vastgesteld dat het gemeten aspect ratio daling werd beperkt tot de cellulaire gebieden met mitochondriën en werd gelijktijdig met de mitochondriale fragmentatie die direct kon worden waargenomen in de fluorescentie beelden van dezelfde cellen. Fig. 5 toont de tijd plots afbeelding van de verandering in de aspect ratio als functie van de tijd in de cellen die apoptose. Binnen iedere cel, is er een daling van de aspect ratio bij T = 60-100 min in de regio's die zich registreert bij een fluorescerende mitochondria, maar niet in regio's die zich inschrijven bij de schemerige achtergrond fluorescentie gebieden.

Figuur 4: Aspect ratio (a) en fluorescentie (b) afbeeldingen van endotheliale cellen behandeld met de apoptose-inductor, staurosporine.

Figuur 5: Tijd plots het vergelijken van de daling van de deeltjes aspect ratio (doelgerichtheid) in de endotheliale cellen behandeld met staurosporine. De individuele sporen te vertegenwoordigen tijd percelen binnen enkele cellen. De daling van de doelgerichtheid is beperkt tot de regio's van de cellen die zich registreert bij een fluorescerende mitochondria (linker paneel) en is afwezig bij de overige achtergrond fluorescentie regio's (rechter paneel).

Nu we hebben vastgesteld dat de beeldverhouding druppel komt overeen met mitochondriale fragmentatie, kunnen wij apoptose in deze cellen, het meten van de fragmentatie met behulp van onze optische verstrooiing methode zonder de cellen label, en onderzoek naar het effect van verschillende genetische en experimentele omstandigheden op deze dynamisch.

Discussie

De hierboven beschreven methode levert morfometrische kaarten van het object dat deeltjesgrootte of oriëntatie voor bijvoorbeeld kunnen coderen. Deze structurele informatie kan worden gebruikt op verschillende manieren:

1. Het kan gebruikt worden als een eerste scherm om weefsel of cel-regio's die zijn veranderd in een specifieke behandeling en dan verder deze regio's te analyseren met een specifieke moleculaire en biochemische assays te identificeren.
2. Het kan worden gebruikt in combinatie me...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	Invitrogen		Low glucose DMEM
Liebowitz L15 medium	Invitrogen		Zonder fenol rood
L-glutamine	Invitrogen
Mitotracker Green	Invitrogen
Bovine Brain Extract	Clonetics
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products
Heparine	Sigma-Aldrich
Staurosporine	Sigma-Aldrich
Dymethylsulfoxide	Sigma-Aldrich
Inverted microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
DMD	Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD	Roper Scientific	Cascase 512B	Hoge (16 bit) dynamische bereik CCD
CCD	Roper Scientific	Coolsnap cf