Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters

Samenvatting

We zien een donker veld microscopie op basis van Gabor-achtige filter om subcellulaire dynamiek maatregel binnen enkele levende cellen. De techniek is gevoelig voor veranderingen in de structuur van de organellen, zoals mitochondriën fragmentatie.

Samenvatting

Demonstreren we een instrument dat microscopisch kleine subcellulaire structuur die voortvloeien uit organel morfologie en de organisatie binnen onbesmet levende cellen kunnen meten. Het voorgestelde instrument breidt de gevoeligheid van de label-free optische microscopie op nanoschaal veranderingen in organel grootte en vorm en kan gebruikt worden om de studie van de structuur-functie relatie met betrekking tot organel dynamiek onderliggende fundamentele biologische processen, zoals de geprogrammeerde celdood of cellulaire versnellen differentiatie. De microscoop kan eenvoudig worden toegepast op de bestaande microscopie platforms, en kan dus worden verspreid aan de individuele laboratoria, waar wetenschappers kunnen implementeren en het gebruik maken van de voorgestelde methoden met onbeperkte toegang.

De voorgestelde techniek is in staat om subcellulaire structuur karakteriseren door het observeren van de cel door middel van twee-dimensionale optische Gabor filters. Deze filters kunnen worden afgestemd op gevoel met nanoschaal (10 van nm) gevoeligheid, specifieke morfologische kenmerken met betrekking tot de grootte en oriëntatie van niet-sferische subcellulaire organellen. Terwijl op basis van contrast gegenereerd door elastische verstrooiing, is de techniek niet op een gedetailleerd inverse verstrooiing model of op de Mie theorie morfometrische metingen te extraheren. Deze techniek is dus van toepassing op niet-bolvormige organellen die een nauwkeurige theoretische beschrijving scatter niet gemakkelijk gegeven, en biedt onderscheidende morfometrische parameters die kunnen worden verkregen binnen onbesmet levende cellen om hun functie te beoordelen. De techniek is voordelig in vergelijking met digitale beeldverwerking in die zin dat direct werkt op het veld van het object te transformeren in plaats van de intensiteit van de gediscretiseerde object. Het is niet afhankelijk van hoge beeld-sampling rates en kan dus worden gebruikt om de morfologische activity snel scherm binnen honderden cellen in een tijd, dus sterk de studie van de structuur organel vergemakkelijken dan individuele organel segmentatie en wederopbouw met behulp van fluorescentie confocale microscopie van de sterk vergrote digitale beelden van beperkte gezichtsveld.

In deze demonstratie laten we de gegevens van een mariene diatomeeën de methodiek illustreren. We laten ook zien voorlopige gegevens verzameld van levende cellen om een ​​idee van hoe de methode kan worden toegepast in een relevante biologische context te geven.

Protocol

1. Aan de cellen klaar

1. De cellen die werden uitgeplaat op de dag voor moeten worden gemerkt met Mitotracker groen voor fluorescentie beeldvorming van de mitochondriën.
2. Verwijder de 100 uM stockoplossing van Mitotracker groen in DMSO eerder gemaakte uit de 4 ° C vriezer, en op kamertemperatuur met de hand. Neem ook uit runderen aorta endotheelcellen (BAEC) celkweekmedium ook eerder bereid en warm tot 37 ° C in de stationaire waterbad.
3. Zodra de Mitotracker en de cultuur medium worden opgewarmd, plaats deze in de motorkap en zorg dat uw handschoenen en alle buitenkant van de containers met 70% ethanol-oplossing te steriliseren. Draai niet ....

Discussie

De hierboven beschreven methode levert morfometrische kaarten van het object dat deeltjesgrootte of oriëntatie voor bijvoorbeeld kunnen coderen. Deze structurele informatie kan worden gebruikt op verschillende manieren:

1. Het kan gebruikt worden als een eerste scherm om weefsel of cel-regio's die zijn veranderd in een specifieke behandeling en dan verder deze regio's te analyseren met een specifieke moleculaire en biochemische assays te identificeren.
2. Het kan worden gebruikt in combinatie me.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	Invitrogen		DMEM met lage glucoseconcentratie
Liebowitz L15 medium	Invitrogen		Zonder fenolrood
L-glutamine	Invitrogen
Mitotracker Green	Invitrogen
Bovien breinextract	Clonetics
Foetaal runderserum	Gemini Bio Products
Heparine	Sigma-Aldrich
Staurosporine	Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich
Inverteermicroscoop	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
DMD	Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD	Roper Scientific	Cascase 512B	CCD met hoog (16 bit) dynamisch bereik
CCD	Roper Scientific	Coolsnap cf