Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellen veranderen uitgebreid in hun locaties en vastgoed tijdens de embryogenese. Deze veranderingen worden geregeld door de interacties tussen de cellen en hun omgeving. Chimère embryo's, die zijn samengesteld uit cellen van verschillende genetische achtergrond, zijn grote hulpmiddelen om de cel-cel interacties gemedieerd door genen van belang te bestuderen. De embryonale transparantie van de zebravis in vroege ontwikkelingsstadia maakt directe visualisatie van de morfogenese van weefsels en organen op cellulair niveau. Hier tonen we een protocol om chimerisch netvlies en de hersenen in zebravis embryo's te genereren en te leven beeldvorming van de donor cellen uit te voeren. Het protocol heeft betrekking op de voorbereiding van de transplantatie naalden, de transplantatie van GFP-expressie donor blastomeren om GFP-negatieve gastheren, en het onderzoek van de donor cel gedrag onder wonen confocale microscopie. Met lichte wijzigingen, kan dit protocol ook gebruikt worden om de embryonale ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis studie. De voordelen van het gebruik van GFP te labelen donor cellen worden ook besproken.
Protocol
Dag 1. Voorbereiding
1. Stel vis kruis
Stel paarsgewijze kruisingen van zebravis in de avond. Om te voorkomen dat willekeurige paring voor de gewenste tijd, gebruik verdelers om de mannelijke en vrouwelijke vissen in de paring cassettes te scheiden. GFP expressie transgene vis wordt gebruikt als een bron van donor blastomeren. De pt104 transgene lijn (Zou et al.., 2008), hier gebruikt, drukt GFP alomtegenwoordig onder de controle van de EF1 promotor. GFP expressie maakt visualisatie van de donor cellen door live-imaging. Andere transgene vis lijnen die geschikt zijn fluorescerende eiwitten te uiten kan wor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze video tonen we een methode voor blastomeer transplantatie in het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen te analyseren in de zebravis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van andere weefsels en organen te analyseren door simpelweg het vrijgeven van de donor blastomeren overeenkomstige plaatsen in de ontvangende embryo's. De etikettering met GFP moleculen levert een schonere achtergrond dan labeling met fluorescente kleurstof-geconjugeerde Dextran (Ho en Kane 1990). Dit komt omdat het .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) en de volgende middelen om XW: NIH Grant R01EY016099 en Onderzoek naar Blindness Career Development Award Prevent. Wij danken Kira Lathrop voor hulp bij confocale beeldvorming.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
E3 ei water:
- 5 mM NaCl
- 0,17 mM KCl
- 0,33 mM CaCl 2
- 0,33 mM MgSO 4
- 0,1% methyleenblauw
Referenties
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). TH....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
