Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles

Samenvatting

Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.

Samenvatting

Cellen zijn geëvolueerd geavanceerde moleculaire machines, zoals kinesine motor eiwitten en microtubuli filamenten, actief intracellulair transport van de lading te ondersteunen. Terwijl kinesins staart domein bindt aan een verscheidenheid van ladingen, kinesins hoofd domeinen maken gebruik van de chemische energie opgeslagen in ATP-moleculen te stappen langs de microtubuli rooster. De lange, stijve microtubules dienen als tracks voor de lange afstand intracellulair transport.

Deze motoren en filamenten kunnen ook worden gebruikt in microfabricated synthetische omgevingen als onderdeel van de moleculaire shuttles ^1. In een vaak gebruikte design, zijn kinesine-motortjes verankerd aan het wegdek door middel van hun staart, en gefunctionaliseerde microtubules dienen als bagageruimte elementen, die worden aangedreven door deze motoren. Deze shuttles kunnen worden geladen met een lading door gebruik te maken van de sterke en selectieve binding tussen biotine en streptavidine. De belangrijkste componenten (gebiotinyleerd tubuline, streptavidine, en gebiotinyleerde lading) zijn commercieel beschikbaar.

Voortbouwend op de klassieke omgekeerde beweeglijkheid test ^2, is de bouw van moleculaire shuttles hier gedetailleerd. Kinesine motor eiwitten geadsorbeerd aan een oppervlak voorgelakt met caseïne; microtubules gepolymeriseerd uit gebiotinyleerd tubuline, gehandeld op grond van de kinesine en vervolgens bedekt met rhodamine-gelabeld streptavidine. De ATP-concentratie is gehandhaafd op subsaturating concentratie om een microtubule zweefvliegen snelheid optimaal te bereiken voor het vervoer van lading ^3. Tot slot, gebiotinyleerde fluoresceïne-gelabelde nanosferen worden toegevoegd als lading. Nanosferen hechten aan microtubuli als gevolg van botsingen tussen glijden microtubuli en nanosferen zich te houden aan de oppervlakte.

Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om een verscheidenheid aan ladingen zoals gebiotinyleerd ^{DNA-4, 5} of quantum dots een breed scala aan antigenen via gebiotinyleerde antilichamen ^4-6 te laden.

Protocol

1.) Buffers en reagentia

Deze oplossingen moeten worden voorbereid en opgeslagen in gemakkelijk grote porties. Een hoeveelheid moeten bevatten voldoende oplossing voor een typisch experiment en een frisse hoeveelheid moet worden gebruikt voor elke beweeglijkheid test. De voorwaarden voor opslag en typische aliquot maten zijn ook vermeld in de volgende protocollen.

1. BRB80 buffer, (80 mm buizen, 1 mM _MgCl2, 1 mM EGTA in gedeïoniseerd gedistilleerd (dd) water, pH ingesteld op 6,9 door KOH)

• Verzin een 100 ml voorraad oplossing van 0,5 M EGTA dd water. Breng de pH op 7,0 met behulp van 2 M NaOH-oplossing.
• Verzin een 100 ml voorraad oplossing van 1 M MgCl ₂ dd water. Autoclave de oplossing.
• Voeg 24,2 g van leidingen en 3,1 g KOH pellets in ongeveer 800 ml water en roer dd op te lossen. Breng de pH tot 6,9 met behulp van 1 M KOH-oplossing. Voeg 2 ml van 0,5 M EGTA stockoplossing aanwezig zijn en een mL van 1 M MgCl ₂ stamoplossing. Breng het volume tot 1000 ml met water dd.
• Aliquot in 50 ml Falcon buizen en invriezen bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. De BRB80 buis momenteel gebruikt kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C of bij kamertemperatuur.

2. Magnesium Chloride, MgCl ₂ (100 mM dd water)

• Verdunnen dd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM te bereiken.
• Hoeveelheid (10 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik

3. Guanosine-5'-trifosfaat, dinatriumzout, GTP (25 mM dd water, pH ingesteld op 7 met NaOH)

• Weeg uit en los op in dd water en breng de pH op 7 met 2 M NaOH-oplossing.
• Controleer of de concentratie door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. (Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 11,7 x 103 M ^-1 cm ^-1).
• Hoeveelheid (10 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

4. Dimethylsulfoxide, DMSO

• Hoeveelheid (10 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

5. Taxol (1 mM in DMSO)

• Afwegen en oplossen in DMSO onder zuurkast tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM te bereiken.
• Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

6. D-(+)-Glucose, (2 M dd water)

• Weeg uit en los op in water dd tot een uiteindelijke concentratie van 2 M. te bereiken
• Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

7. Glucose-oxidase, (2 mg / ml in BRB80)

• Los op in BRB80 tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml te bereiken.
• Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

8. Dithiothreitol, DTT (1 M dd water)

• Los op in water onder dd zuurkast tot een uiteindelijke concentratie van 1 M. te bereiken
• Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

9. Catalase, (0,8 mg / ml in BRB80)

• Oplossen in BRB80 in ten minste twee fasen tot een uiteindelijke concentratie van 0,8 mg / ml te bereiken. Bepaal de concentratie in ieder stadium door het meten van UV-absorptie bij 276 nm en 406 nm (gebruik een extinctiecoëfficiënt van 3,1 x 10 ⁵ m ^-1 cm ^-1 bij 276 nm en 2,2 x 10 ⁵ M ^-1 cm ^-1 bij 406 nm en de vergelijking A = CL).
• Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

10. Adenosine-5'-trifosfaat, ATP (100 mM in 100mm MgCl ₂₎

• Bereid een voorraad oplossing van 100 mM MgCl ₂ dd water. Afwegen droog poeder en los op in dit bestand oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 100 mm te bereiken.
• Controleer of de concentratie door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. (Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 15,4 x 10 ³ M ^-1 cm ^-1).
• Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

11. Caseïne-oplossing (20 mg / ml caseïne in BRB80)

• Voeg ongeveer 3 g caseïne tot 30 ml water in een dd 50 ml Falcon buis. Vortex voor ongeveer 1 uur tot oplossing ontwikkelt dikke consistentie.
• Centrifugeer bij ongeveer 15.000 g gedurende 30 minuten. De bovendrijvende vloeistof filteren door middel van 0,5 micrometer en 0,2 um spuit filters.
• Bepaal de concentratie van de bovenstaande vloeistof door het meten van UV-absorptie bij 280 nm (Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 0,67 mL mg ^-1 cm ^-1). Verdund tot 20 mg / ml in BRB80.
• Hoeveelheid (20 pi volume) intot 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

2.) Standaard oplossingen

Deze worden bereid op de dag van het experiment en dient te worden weggegooid na het experiment voorbij is. Bereid 1 ml van elk.

1. BRB80CS0.5

• Verdunnen caseïne oplossing in BRB80 tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 mg / ml en op te slaan over ijs. Deze oplossing is geïntroduceerd in de stroom cel voorafgaand aan de kinesine en het behoud van kinesine activiteit na oppervlak van adsorptie.

2. BRB80CA

• Bereid 0,2 mg / ml caseïne en 1 mM ATP in BRB80 en op te slaan over ijs. Kinesine verder verdund met behulp van deze oplossing vóór de invoering in de stroom cel.

3. BRB80T

• Verdunnen taxol oplossing in BRB80 tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing wordt gebruikt om de microtubuli stabiliseren.

4. BRB80CT

• Bereid 10 uM taxol en 0,2 mg / ml caseïne in BRB80 en bewaar bij kamertemperatuur. Dit wordt gebruikt voor de verdere voorbereiding van de antifade en microtubule oplossingen.

5. BRB80AF

• Bereid 20 mM D-glucose, 20 ug / ml glucose-oxidase, 8 ug / ml catalase, 10 mM DTT en 20 uM ATP in BRB80CT en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing wordt gebruikt voor het streptavidine en nanosferen verdunnen en "verdrinken" de overtollige streptavidine in de stroom cel. De kinesine snelheid kan worden geregeld door het aanpassen van de ATP-concentratie in deze oplossing.

3.) Kinesine Voorbereiding

• Express een kinesine constructie bestaande uit de wild-type, full-length Drosophila melanogaster kinesine zware keten en een C-terminale His-tag in Escherichia coli en zuiveren met behulp van een Ni-NTA column, zoals beschreven in ^zes.
• Maak monsters (10 pi elk) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. De concentratie van de actieve kinesine in deze porties is ongeveer 200 nM. ⁷
• Voor een typisch experiment, verdun de oplossing kinesine 20 vouwen in BRB80CA. Label de oplossing KIN20 en op te slaan over ijs.

4.) Microtubuli Voorbereiding

• In een 0,5 ml microcentrifugebuis, bereiden 25 pi van de groei oplossing: 4 mM _MgCl2, 1 mM GTP en 5% DMSO (v / v) in BRB80 buffer.
• Voeg 6,25 pi van deze oplossing voor een 20 ug aliquot van gevriesdroogde gebiotinyleerd tubuline.
• Vortex, vervolgens plaats in een warmte-bad op 37 ° C gedurende 30 minuten te polymeriseren. Verdun 100-voudig in BRB80T en vortex voorzichtig. Label de oplossing MT100 en bewaar bij kamertemperatuur.
• Maak een 10-voudige verdunning van MT100 in BRB80AF. Label de oplossing MT1000.

5.) Streptavidine en NanoSphere Solution

Bereid AlexaFluor568-gelabeld streptavidine bij een concentratie van 100 nM in BRB80AF. Labelen STV100 en op te slaan over ijs. Ook verdunnen nanosferen 5000 vouw in BRB80AF oplossing. Labelen NS5000 en op te slaan over ijs.

6.) Flow Cell Bouw

Construeer een doorstroomcel met behulp van twee glazen dekglaasjes van elkaar gescheiden door dubbelzijdig tape. Deze stroom cel is ongeveer 2 cm lang, 1 cm breed en 100 micrometer hoog en heeft een volume van ongeveer 20 pi. Oplossingen worden ingevoerd in de flow cel van de ene kant met een pipet en slecht uit de andere met behulp van filter papier.

7.) Omgekeerde Assay Vergadering

Glazen oppervlak wordt eerst bekleed met caseïne die het mogelijk maakt kinesine om de functionaliteit te behouden bij adsorptie. Nadat kinesine is geadsorbeerd, zijn microtubuli geïntroduceerd, die worden gehouden door kinesine. Microtubuli worden vervolgens bedekt met fluorescerende streptavidine. Na het wassen van de overtollige streptavidine, zijn gebiotinyleerde polystyreen fluoresceïne nanosferen (40 nm diameter) geïntroduceerd. Oppervlak geadsorbeerd stationaire nanosferen botsen met de bewegende microtubuli en krijg geladen hen (figuur 1).

De volgorde van de stroom van oplossingen en toegestane tijd vóór de invoering van de volgende oplossing zijn hieronder vermeld.

• BRB80CS0.5, 5 minuten
• KIN20, 5 minuten
• MT1000, 5 minuten
• STV100, 5 minuten
• BRB80AF, 3x
• NS5000

8.) Microscopie

Monteer de flow cel op de microscoop podium direct na NanoSphere introductie. In dit experiment, een Eclipse TE2000-U fluorescentie microscoop (Nikon, Melville, NY) is uitgerust met een 100X olie doelstelling (NA 1,45), een X-cite 120 lamp (Exfo, Ontario, Canada) en een IXON EMCCD camera (ANDOR, South Windsor, CT) werd gebruikt. Een FITC filter kubus (# 48001) en een TRITC filter kubus (# 48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT) werden gebruikt om beeld nanosferen en microtubuli respectiVely aan de onderkant van flow cellen. De belichtingstijd was 0,2 s, terwijl de tijd tussen blootstelling werd 2 s.

Figuur 1. Schematische tekening van de moleculaire shuttles.

Discussie

Met kleine aanpassingen, is dit protocol met succes toegepast door een verscheidenheid van groepen om kinesine-microtubule op basis van de beweeglijkheid testen monteren. 10 mM DTT in de uiteindelijke beweeglijkheid oplossing kan worden vervangen door 0,5% β-mercapto-ethanol. Standaardoplossingen (BRB80AF, KIN20 en MT1000) meer dan 2 uur oud is mag niet gebruikt. Elke oplossing die taxol en vooral microtubuli mag nooit geplaatst worden op het ijs. Overmatige blootstelling van de stroom cel aan UV-excitatie licht resulte...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adenosine-5’-trifosfaat (ATP)	Invitrogen	A1049
Biotine-tubuline	Cytoskeleton, Inc.	T333
Caseïne	Sigma-Aldrich	C-0376
Catalase	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Dithiothreïtol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Ethyleenglycol-bis(2-amin–ethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
FluoSpheres gebiotinyleerde microsferen, 40 nm, geel-groen fluorescent (505/515)	Invitrogen	F-8766
Glucose-oxidase	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanosine-5’-trifosfaat (GTP)	Roche Group	106399
Magnesiumchloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paclitaxel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
1,4-piperazinediethansulfonzuur, piperazine-1,4-bis(2-ethansulfonzuur), piperazine-N,N′-bis(2-ethansulfonzuur) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Kaliumhydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Natriumhydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Streptavidine Alexa Fluor 568 conjugaat	Invitrogen	S11226