De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Samenvatting

Deze video toont een protocol methode voor het genereren van transgene Xenopus laevis Door de introductie van transgenen in spermakernen gevolgd door nucleaire transplantatie in onbevruchte eieren.

Samenvatting

Stabiele integratie van gekloonde gen producten in de Xenopus genoom is nodig om de tijd en plaats van meningsuiting controle, om genen te uiten in een later stadium van de embryonale ontwikkeling, en om te bepalen hoe enhancers en initiatiefnemers van genexpressie reguleren binnen het embryo. Het protocol blijkt hier kan gebruikt worden om efficiënt te produceren transgene Xenopus laevis embryo's. Deze transgenese wordt in drie delen: 1. Spermakernen zijn geïsoleerd van volwassen X. laevis testis door behandeling met lysolecithin, waarbij het ​​sperma plasmamembraan permeabilizes. 2. Ei extract wordt bereid door lage snelheid centrifugeren, toevoeging van calcium aan het extract zorgen om de voortgang te interfase van de celcyclus, en een high-speed centrifugatie om interfase cytosol isoleren. 3. Nucleaire transplantatie: de kernen en extract worden gecombineerd met de gelineariseerde plasmide DNA worden ingevoerd als het transgen en een kleine hoeveelheid van de restrictie-enzym. Tijdens een korte reactie, ei-extract decondenses gedeeltelijk het sperma chromatine en de restrictie-enzym genereert chromosomale breekt dat recombinatie van het transgen te bevorderen in het genoom. De behandelde spermakernen worden vervolgens getransplanteerd in onbevruchte eieren. Integratie van het transgen gebeurt meestal voorafgaand aan de eerste embryonale klieving zodanig dat de ontstane embryo's niet chimerisch zijn. Deze embryo's kunnen worden geanalyseerd zonder dat te fokken voor de volgende generatie, waardoor een efficiënte en snelle generatie van transgene embryo's voor analyses van de promotor en gen functie. Volwassen X. laevis als gevolg van deze procedure ook propageren het transgen door de kiembaan en kan gebruikt worden om lijnen van transgene dieren voor meerdere doeleinden te genereren.

Protocol

Gewijzigde versies van deze transgenese aanpak werden in eerste instantie beschreven in ¹ en ^2.

A. spermakernen voorbereiding

Deze kernen bereidingsmethode is een bewerking van Murray ^3, maar de proteaseremmers zijn weggelaten omdat ze interfereren met verdere ontwikkeling van eieren getransplanteerd met sperma kernen. Porties worden ingevroren bij -80 ° C en kan gebruikt worden voor transplantaties voor ongeveer 6 maanden.

Alle oplossingen moeten worden voorbereid en op ijs geplaatst voorafgaand aan het begin van de voorbereiding.

1. Verdov....

Discussie

Voor elke transgene construct te testen, hebben we over het algemeen transplantatie kernen in 500-1000 eieren, op deze schaal, kunnen we het genereren van transgene embryo's uitdrukken tot 10 verschillende constructen per dag, afhankelijk van het aantal vrouwtjes worden aangezet om eieren te leggen. Van deze transplantaties, ongeveer een derde van de eieren aankleven en 60-80% van deze embryo's splitsen normaal verder door gastrulatie. Afhankelijk van de gebruikte reactie-omstandigheden, tussen de 10-50% van dez.......

Materialen

A. spermakernen voorbereiding

Reagentia:

1. 1X MMR (2mm _CaCl2, 5mM HEPES, pH 7,5, 2 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 100mm NaCl).
2. 0,1% tricaïne methaansulfonaat (MS222, aminobenzoëzuur ethyl ester, Sigma A-5040), 0,1% natriumbicarbonaat. Los op in water.
3. 2X Nuclear Voorbereiding Butter (NPB). Op de dag van het sperma kernen voorbereiding, make-up 30 ml 2X NPB uit hoeveelheden van de voorraad oplossingen in bevroren toestand bewaard: 500 mM sucrose (1,5 M stock), 30 mM HEPES (1M voorraad; titreer met KOH, zodat de pH 7,7 is op 15 mm), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501, 10 mM voorraad), 0,4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141, 10 mM voorraad), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632, 100 mM voorraad), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0).
4. Gebruik de 2XNPB om a. te maken 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB +3% BSA (fractie V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB +0,3% BSA.
5. Lysolecithin: 100 pi van 10 mg / ml L-α-lyso-lecithine, eigeel (Calbiochem, 440154); te ontbinden bij kamertemperatuur vlak voor gebruik. Bewaar stevige voorraad bij 20 ° C. Gooi de bouillonpoeder indien het wordt plakkerig.
6. Bovine serum albumine (BSA): 10% (w / v) BSA (fractie V, Sigma A-7906) Make-up 5 ml in het water op de dag van de spermakernen voorbereiding.
7. Spermaopslag buffer (1 ml) 1x NPB, 30% glycerol, 0,3% BSA.
8. Sperma verdunningsbuffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM spermine tetrahydrochloride. Titratie tot pH 7,3-7,5 en op te slaan 0,5-1 ml aliquots bij 20 ° C.
9. Hoechst No 33342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml bouillon in dH ₂ O, op te slaan in een lichte strakke vat bij 20 ° C.

Uitrusting:

• Swinging emmer rotor en centrifuge
• kaasdoek
• dissectie tools (tangen en scharen)
• fluorescentie microscoop
• trechter
• handschoenen
• hemocytometer
• naalden (26 gauge)
• papieren handdoeken
• petrischalen (60 mm)
• pipetten
• plastic (5 en 10 ml)
• Pipetman tips (1 ml en 200μl)
• Spuiten (1 ml)
• buizen (14 ml, Falcon, 2059)
• buizen
• microcentrifuge (1,5 ml)

B. Bereiding van High Speed ​​Extract

Reagentia:

1. 1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl _{2, 2} mM _CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,5. Bereid een 10X voorraad, en pas de pH met NaOH tot 7,5.
2. 20X Extract buffer (XB) zout voorraad: 2 M KCl, 20 mM MgCl _{2, 2} mM _CaCl2, filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C.
3. Extract buffer (XB, vers bereid en bewaard op ijs): 1X XB zouten, 50 mM sucrose, 10mm HEPES (1 M voorraad, getitreerd met KOH, zodat de pH is 7,7 bij verdund tot 15 mm; filter-steriliseren, en bewaar in porties bij 20 ° C). Bereid je ongeveer 100 ml.
4. 2% (w / v) L-cysteïne hydrochloride 1-hydraat: Made in 1X XB zouten voor gebruik en getitreerd tot pH 7,8 met NaOH. Bereid je ongeveer 300 ml.
5. CSF-XB: 1X XB zouten, 1 mM MgCl ₂ (naast de ₂ aanwezig is in XB zouten MgCl; uiteindelijke concentratie 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7,7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7,7. Bereid 50 ml.
6. Proteaseremmers: Mengsel van leupeptin, chymostatin, en pepstatine, elk opgelost tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaren in kleine porties bij 20 ° C.
7. 1 M CaCl _2.
8. Energie-mix: 150 mM creatine fosfaat, 20 mM ATP, 20 mM MgCl _2.
9. Zwangere Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc, 021825). Los op in water en opgeslagen bij 20 ° C.
10. Humaan choriongonadotrofine (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc, 057176). Los op in water en opgeslagen bij 4 ° C.

Uitrusting:

• Xenopus laevis vrouwen
• Naalden (18 en 26 gauge)
• Pasteur pipet
• wijde boring
• Spuiten (1 ml)
• , Microcentrifuge (0,5 ml)
• Tubes, dikke polycarbonaat (Beckman, 349622)
• Buizen, UltraClear (14 x 95 mm, Beckman, 344060)
• Ultracentrifuge en rotoren (bijvoorbeeld Beckman TL-100 met rotors SW 40 Ti en TLA-100.3)
• Bekers voor de ei-collectie
• Emmers of containers voor het houden van vrouwelijke kikkers (bijvoorbeeld 4-L plastic bekers met deksels mesh).

C. Celkerntransplantatie.

Reagentia:

1. 2,5% agarose in 0.1XMMR (voor het maken injectie gerechten)
2. 2,5% cysteïne in 1XMMR, PH8.0, bereid op de dag van gebruik
3. Ficoll
4. 10 mg / ml gentamycine (1000X voorraad)
5. hoge snelheid ei-extract (zie boven)
6. 100 MgCl ₂
7. 10X MMR (zie hierboven)
8. Restrictie-enzym (bijv. Notl van New England Biolabs)
9. Sperma verdunningsbuffer (SDB, zie hierboven) en sperma kernen (zie boven)
10. Humaan choriongonadotrofine (HCG) zoals hierboven
11. minerale olie (Sigma, M8410)
12. Gelineariseerd plasmide worden ingevoerd als het transgen: Maak gelineariseerd plasmide bij een concentratie van ongeveer 100 ng / ul in steriele, nuclease-vrij water (we vermijden Tris en EDTA-bevattende buffers, die zijn enigszins giftig voor embryo's). De restrictie-enzym gebruikt om het plasmide te lineariseren hoeft niet hetzelfde te zijn als het wordt gebruikt in de nucleaire overdracht reactie. We gebruiken meestal Notl voor alle reacties, ongeacht wat plasmide wordt gelineariseerd met. Sommige kalibratie van het enzym verdunning gebruikt in de reactie kan het nodig zijn, kan als te veel enzym schadelijke gevolgen hebben voor post-gastrula ontwikkeling. Plasmide kan worden gezuiverd op verschillende manieren: we meestal de Qiagen QIAquick PCR zuivering kit gebruik volgens de fabrikant richtingen; zuivering van een enkele band van een gel is niet nodig. Als plasmide wordt gezuiverd met behulp van fenol / chloroform extractie en ethanol precipitatie, zeker om alle sporen van organische en ethanol te verwijderen.

Uitrusting:

Agarose gerechten voor injectie: In een 60 mm plastic petrischaaltje lag een klein bootje 35mmX35mm wegen op gesmolten 2,5% agarose in water 0.1XMMR om een ​​depressie te maken met een agarose-gecoate bodem voor het vullen met eieren. Zodra agarose is uitgehard, wikkel in parafilm en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Maak 2-3 gerechten op voorhand voor elke reactie transgene u van plan bent te doen.

Infusiepomp: We maken gebruik van een enkele spuit infusiepomp van Harvard Apparatuur, voorzien van een 3 cc spuit / naald gevuld met minerale olie (Sigma M-8410). Stompe de naald tip (om te voorkomen dat perforeren de slang) en bevestig de fijne Tygon slang. Laat de pomp op ~ 10nl/sec, dit gaat ervan uit dat de tijd dat de naald in elk ei zal niet groter zijn dan 1 sec. Pomp moet worden pre-run gedurende enkele minuten vóór het begin van transgenese voor de dag om te verzekeren dat de zuiger van de spuit is gelijk met de zuiger en dat de gestage positieve stroom van olie uit de slang zich voordoet.

Naalden voor nucleaire overdrachten. Met behulp van een micropipet trekker, het genereren van naalden met lange, schuin tips. Clip deze met een pincet in een dissectiemicroscoop uitgerust met een oculair micrometer tot een ~ 80 micron opening te verkrijgen met een schuine vorm.

Andere apparatuur: Xenopus laevis vrouwen, stereomicroscoop, incubator, micromanipulator, micro-injectie naald puller (bijv. Model P-87, Sutter), injectienaalden (26 gauge), glas micro-injectie naalden, oculair micrometer voor gekalibreerde knippen van micro-injectie naald tips om 80μm diameter, petrischalen, wegen boten 35mm, Tygon slangen (ID = 1 / 32 inch, OD = 3 / 32 inch)