Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Samenvatting

Bron: Prior, H., et al. Een snelle en facile pijpleiding voor het genereren van genomische punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR / Cas9 Ribonucleoproteïnen. J.Vis. Exp. (2018). 

Deze video beschrijft een techniek om een enkel nematode snel te screenen op een genetische marker door PCR-screening. In het voorbeeldprotocol screenen we op CRISPR-gebaseerde genoombewerking.

Protocol

Het volgende protocol is een uittreksel uit Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

Single Worm PCR en Genotypering

1. Breng na 1 - 2 dagen leggen de F₁s over in individuele PCR-stripbuisdoppen met 7 μL wormlysisbuffer met behulp van een wormpluk(tabel 1, figuur 1D,dag 4 - 5).
2. Centrifugeer PCR-buizen op maximale snelheid gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om dieren naar de buisbodem te brengen en vries buizen bij -80 °C gedurende 1 uur.
   OPMERKING: Wormen kunnen voor onbepaalde tijd bij -80 °C worden bewaard.
3. Lyse bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma: 60 °C gedurende 60 min, 95 °C gedurende 15 min, 4 °C hold.
4. Pcr mastermix instellen zoals weergegeven in tabel 2.
5. Voeg 21 μL PCR-mastermix toe aan schone PCR-buizen en voeg vervolgens 4 μL wormlyse toe vanaf stap 3. Meng goed met behulp van een pipet en voer het PCR-programma uit volgens de richtlijnen van de fabrikant (zie materialentabel).
6. Zuiver PCR-reacties met behulp van een DNA Clean and Concentrate-kit, volgens de instructies van de fabrikant (zie materialentabel). Elute DNA door 10 μL water toe te voegen aan de spinkolom.
7. Opstelling beperking enzym mastermix zoals weergegeven in tabel 3.
8. Voeg 10 μL van het restrictie-enzym mastermix toe aan elke gereinigde PCR-reactie en incubeer gedurende 1 - 2 uur bij 37 °C.
9. Afzonderlijke verteerde PCR-producten op een 1,5% agarosegel lopen op 120 V met behulp van 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer.

Resultaten

Figuur 1. CRISPR-Cas9 engineering van deC. eleganssod-1 locus. (A) Schematische illustratie die de exon-intronstructuur van de zode-1 locus in C. elegans afschildert. De rode balk geeft de locatie van G93 in exon 3 aan. De primer paar set wordt opgemerkt door de rode pijlen (F1-R1). (B) Sequentie uitlijning van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780