RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli

Samenvatting

Bron: Kolundzic, E., et al. Toepassing van RNAi en heat-shock-geïnduceerde transcriptiefactorexpressie om kiemcellen te herprogrammeren op neuronen in C. elegans. J.Vis. Exp. (2018).

Deze video beschrijft de principes achter de RNAi-behandeling bij C. elegans en demonstreert een protocol om lin-35 in een transgene wormstam neer te slaan.

Protocol

Dit protocol is overgenomen uit Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Oplossingsvoorbereiding
   1. NGM-Agar platen (1 L)
      1. Voeg 3 g NaCl, 2,5 g pepton media (bijv. Bacto-Peptone) en 20 g agar toe. Voeg na autoclaaf 1 ml cholesterol toe (5 mg/ml in 95% EtOH-voorraad), 1 ml van 1 M MgSO_4,1 ml van 1 M CaCl2, 25 ml van 1 M K2PO₄

Resultaten

Figuur 1: Pvul fenotype veroorzaakt door RNAi tegen lin-53. (Boven) DIC-beeld van L4/young adult stadium F1-nakomelingenwormen afgeleid van controle of lin-53 RNAi behandelde moeders. Schaalbalken = 20 μm. (Onder) Dieren behandeld met lin-53 RNAi geven het uitstekende vulva (pvul) fenotype (zwarte pijlpunten) weer. Het pvul fenotype bevestigt dat RNAi tegen lin-53

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
<strong>Chemicals&nbsp;</strong>
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone&nbsp;	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media&nbsp;
Yeast extract&nbsp;	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth&nbsp;	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth&nbsp;	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
<strong>Incubators</strong>
Incubator&nbsp;	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 &deg;C or 25 &deg;C
<strong>Microscopes</strong>
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
<strong>Bacterial strains</strong>
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50&nbsp;			Uracil auxotroph E. coli strain
<strong>Worm strains</strong>
BAT28:&nbsp;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
<strong>RNAi Clones</strong>
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene&nbsp;	#1654