$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dit protocol is een uittreksel uit Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Calcium beeldvorming
- Gebruik transgene stammen die genetisch gecodeerde calciumsensoren zoals HBR16 uitdrukken (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Gebruik een samengestelde microscoop die is uitgerust voor breedveldepifluorescentie. Sluit de TTL-uitgang van de EMCCD-camera aan op de TTL-ingang van de LED, zodat telkens wanneer de camera een frame opneemt, het monster wordt verlicht. Gebruik een belichtingstijd van ongeveer 5 msec. Gebruik EM gain in het bereik van 50 - 300.
- Geef een burst-film op die 24 uur draait, waarbij elke worm elke 15 - 30 minuten wordt afgebeeld, eerst gedurende 20 seconden met DIC, vervolgens gedurende 20 seconden met een GFP-fluorescentie om GCaMP op te nemen en maak vervolgens een laatste afbeelding van het mKate2-signaal dat wordt genomen om te bepalen voor expressieniveaus. Gebruik een framesnelheid van 2/sec tijdens elke burst.
- Gebruik voor visuele gegevensinspectie een kaart met valse kleuren om de zichtbaarheid van kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te verbeteren. Plot fluorescerende gegevens als ΔF/F, waarbij F de gemiddelde basiswaarde van fluorescentie is. Een gedetailleerde beschrijving van calciumgegevensanalyse is te vinden in de literatuur.