FITC-Dextran Feeding: een methode om intestinale permeabiliteit te kwantificeren bij C. elegans

Samenvatting

Bron: Le, T. A. N., et al. Het meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de darmpermeabiliteit van Caenorhabditis elegans. J.Vis. Exp. (2019). 

Deze video introduceert een methode om de integriteit van het C. elegans darmlumen te visualiseren en te meten door wormen fitc-gelabelde dextran te voeren.  Het voorbeeldprotocol toont de test die is uitgevoerd met 3,3'-diindolylmethane (DIM)-behandelde en door ziekteverwekkers gevoede wormen.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Voorbereiding van NGM-platen voor het testen van de effecten van een chemische stof (DIM) op de darmpermeabiliteit van C. elegans gevoed met P. aeruginosa
   1. Voeg 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml gedestilleerd water, een magneetroerder en 6,8 g agar toe aan een glazen fles van 500 ml (NGM-agar).
   2. Voeg 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml gedestilleerd water en een magneetroerder zonder agar toe aan nog een glazen fles van 500 ml (NGM-bouillon).
   3. Autoclaaf de twee flessen (van stap 1.1–1.2), een lege glazen fles van 100 ml en een lege glazen fles van 500 ml gedurende 15 minuten bij 121 °C. Laat vervolgens het medium met flessen gedurende 30 minuten afkoelen tot 55 °C in het waterbad. Bewaar het agar medium in het waterbad en verwijder de fles met bouillon (vanaf stap 1.2) voor de volgende stap.
   4. Voeg de additieve chemicaliën toe aan de NGM-bouillon: 0,4 ml 1 M CaCl₂, 0,4 ml cholesterol in ethanol (ml), 0,4 ml van 1 M MgSO₄ en 10 ml van 1 M KPO₄ (al deze componenten moeten worden gesteriliseerd, afgezien van het cholesterol in ethanol). Roer het mengsel vervolgens grondig met een magneetroerder op 55 °C.
   5. Etiket de autoclaaf lege 500 ml glazen fles met dimethylsulfoxide (DMSO) en de autoclaaf lege 100 ml glazen fles met DIM.
   6. Breng 50 ml NGM-bouillon over in de DIM-gelabelde fles van 100 ml. Voeg 500 μL 20 mM DIM bouillon toe aan de fles en meng goed.
      OPMERKING: DIM wordt opgelost in DMSO (20 mM DIM voorraad).
   7. Verwijder snel het NGM-agarmedium uit het waterbad, voeg 50 ml van het NGM-agarmedium toe aan de DIM-gelabelde fles en meng grondig.
   8. Plaats een 20 ml aliquot DIM-bevattend NGM-medium in elke petrischaal van 90 mm x 15 mm. Vanuit deze stap kunnen ongeveer vijf DIM-bevattende NGM-platen worden gemaakt.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie DIM in elke NGM-plaat is 100 μM.
   9. Om de DMSO-bevattende NGM-plaat te bereiden, breng je 150 ml NGM-bouillon over in de DMSO-gelabelde fles van 500 ml. Voeg 1,5 ml DMSO toe aan de fles en meng goed.
   10. Voeg 150 ml van het NGM-agarmedium toe aan de DMSO-gelabelde fles en meng grondig.
   11. Plaats een 20 ml aliquot DMSO-bevattend NGM-medium in elke petrischaal van 90 mm x 15 mm. Vanuit deze stap kunnen ongeveer vijftien DMSO-bevattende NGM-platen worden gemaakt.
       OPMERKING: De uiteindelijke concentratie DMSO in elke NGM-plaat is 0,5%.
   12. Verstevig de platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 uur en bewaar ze bij 4 °C tot gebruik.
       OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
   13. Haal de E. coli OP50 of P. aeruginosa PAO1 kweek uit de 4 °C koelkast en draai de kweek goed om voordat u zich op de NGM platen verspreidt.
   14. Leg 800 μL van de E. coli OP50 of P. aeruginosa PAO1 bacteriecultuur op elke verse NGM agarplaat en laat de platen 's nachts drogen in een incubator van 20 °C.
       OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Voor het derde experiment (figuur 1) werden twee DMSO-bevattende NGM-platen met een laag laag onder de levende E. coli OP50, één DMSO-bevattende NGM-plaat met een laagje levende P. aeruginosa PAO1 en één DIM-bevattende NGM-plaat met een laag onder de levende P. aeruginosa PAO1 bereid.
2. Behandeling van bacteriën of DIM en FITC-dextran voeding
   1. Incubeer de leeftijdssynchrone eieren bij 20 °C gedurende 64 uur op NGM-platen aangevuld met levende E. coli OP50 als voedsel.
   2. Was de leeftijdssynchrone L4-larve met S-buffer en breng ze (meer dan ongeveer 500 wormen) over naar de NGM-platen die verschillende bacteriën en chemicaliën bevatten. Incubeer ze bij 20 °C gedurende 48 uur.
      OPMERKING: De behandelingstijd kan variëren van 24 tot 72 uur, afhankelijk van de gebruikte bacteriën en chemicaliën. Het therapeutische of preventieve effect van DIM kan ook worden geëvalueerd door de wormen voor te behandelen met pathogenen en vervolgens de wormen te behandelen met DIM (het therapeutische effect) of door de wormen voor te behandelen met DIM en vervolgens te behandelen met pathogenen (het preventieve effect).
   3. Om de fitc-dextran-aangevulde platen te bereiden, mengt u 2 ml warmte-geactiveerde E. coli OP50 met 4 mg FITC-dextran. Verdeel vervolgens 100 μL van het FITC-dextran- en E. coli OP50-mengsel in twintig verse NGM-agarplaten (60 mm x 15 mm) en laat de platen 1 uur drogen op een schone bank.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie FITC-dextran in elke NGM-plaat is 20 μg/ml.
   4. Bereid vijf E. coli OP50-bevattende NGM-platen zonder FITC-dextran voor op de voertuigcontrolebehandeling. Verdeel hiervoor 100 μL warmtegeïnactiveerde E. coli OP50 over elke verse NGM-agarplaat (60 mm x 15 mm) en laat de platen 1 uur drogen op een schone bank.
      OPMERKING: Voor elk onafhankelijk experiment zijn vijftien FITC-dextran-aangevulde NGM-platen en vijf NGM-platen zonder FITC-dextran vereist.
   5. Was na 48 uur behandeling (vanaf stap 2.2) de wormen met S-buffer, breng de wormen over naar de FITC-dextran aangevulde platen en de NGM-platen zonder FITC-dextran en incubeer de platen 's nachts (14-15 uur).
      OPMERKING: Voor elke behandelingsgroep zijn 5 duplo's van FITC-dextran-kleuring (of voertuigbesturingsvoeding) vereist.
   6. Was de wormen met S-buffer en laat ze 1 uur in de verse NGM agarplaat kruipen.
      OPMERKING: Voor elk onafhankelijk experiment zijn in totaal 20 verse NGM-platen nodig. In deze stap kunt u de NGM-plaat gebruiken die zonder of met E. coli OP50 wordt aangevuld.
   7. Voeg 50 μL 4% formaldehydeoplossing toe aan elke put van een zwarte 96-put vlakke bodemplaat. Breng ongeveer 50 wormen van elke NGM-plaat over in elke put voor fluorescentiemetingen. Verwijder na 1 tot 2 minuten alle formaldehyde uit elke put en voeg 100 μL montagemedium toe om de putten te coaten.
      OPMERKING: Formaldehydeoplossing (4%) wordt gebruikt om de wormen te immobiliseren en te repareren. Voor elke behandelingsgroep worden 5 putten (5 replica's) gebruikt voor beeldanalyse.
3. Imaging C. elegans met het Operetta Imaging System en bepaling van intestinale permeabiliteit door het meten van de FITC-dextran fluorescentie opname
   OPMERKING: Fluorescerende stereomicroscopie kan worden gebruikt voor beeldanalyse in plaats van het Operetta-systeem.
   1. Leg fluorescentiebeelden vast en meet de fluorescentie-intensiteit met behulp van het Operetta High-Content Imaging System en analyseer de beelden met Harmony-software.
   2. Druk in de Harmony-software op het pictogram Deksel openen om het deksel te openen en de plaat in de machine te plaatsen.
   3. Stel de parameters in.
   4. Klik op Instellen, selecteer het plaattype (96-well corning flat-bottom) en voeg de kanalen (bright-field en EGFP kanalen) toe.
   5. Pas de lay-out aan. Ga naar de selectie Lay-outen selecteer vervolgens Bijhouden en pas de parameters aan (eerste afbeelding op 1 μm, aantal vlakken is 10, afstand is 1 μm).
   6. Selecteer een van de behandelputten en één opnameveld en druk op Test om te controleren of de foto's bevredigend zijn in de sectie Experiment uitvoeren.
   7. Als de foto's bevredigend zijn, gaat u terug naar de sectie Instellen en drukt u op het resetpictogram aan het einde van het scherm. Selecteer vervolgens alle doelputten en een geschikt aantal opnamevelden.
   8. Ga naar Experiment uitvoeren en voer de bestandsnaam in en druk vervolgens op Start om te beginnen met verwerken.
   9. Als u de intensiteit van de fluorescentie wilt meten, gaat u naar de sectie beeldanalyse en voert u de afbeelding in. Zoek de cel door het EGFP-kanaal en methode B te kiezen. Pas de gemeenschappelijke drempel aan op 0,5, gebied op >200 μm², splitfactor op 3,0, individuele drempel op 0,18 en contrast op meer dan 0,18. Bereken vervolgens de intensiteitseigenschappen en kies het gemiddelde als uitvoer. Druk op het pictogram Toepassen om de installatie op te slaan.
   10. Ga naar de sectie Evaluatie om de intensiteit te meten door een heatmap en gegevenstabel te verkrijgen. Stel de uitlezingsparameter in op Cellen — Intensiteit Cel EGFP Gemiddelde — Gemiddelde per put en start de evaluatie.
       OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
   11. Als u de gegevens uit Operetta wilt extraheren, klikt u op de knop Instelling en kiest u Gegevensbeheer.
   12. Kies Archief schrijvenen open vervolgens bladeren en selecteer het bestand.
   13. Als u het bestand wilt selecteren, klikt u op het kleine + signaal in de linkerhoek en klikt u vervolgens op Meten en kiest u Plaatnaam.
   14. Selecteer het bestand en klik op OK.
   15. Selecteer het pad om het bestand op te slaan door op het bladersignaal op het actieve pad te klikken.
   16. Klik op Start om het gegevensbestand op te slaan.
       OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
4. Statistische analyse van de FITC-dextran fluorescentie van C. elegans
   1. Importeer de gegevens en bereken de gemiddelde en standaarddeviatie (SD) met behulp van een statistiekensoftware.
   2. Analyseer het significante verschil met eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door tukey's meervoudige vergelijkingstest.

Resultaten

Figuur 1: Het effect van DIM op de darmpermeabiliteit van C. elegans gevoed P. aeruginosa. Microscopiebeelden van wormen van (A) E. coli OP50 zonder FITC-dextran voeding, (B) E. coli met FITC-dextran voeding, (C) P. aeruginosa PAO1 met FITC-...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3,3’-diindolylmethane 	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution 	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type 
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software 	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate 	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	 HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N