Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro</em

Samenvatting

T-lymfocyt migratie vindt plaats tijdens homing aan lymfoïde organen, het verlaten van het vaatstelsel en het aangaan van perifere weefsels. We beschrijven hier een protocol dat gebruikt kan worden om T-lymfocyten migratie te analyseren In vitro.

Samenvatting

De migratie van T-lymfocyten houdt de lijm interactie van het celoppervlak integrines met liganden uitgedrukt op andere cellen of met extracellulaire matrix eiwitten. De precieze spatiotemporele activering van integrines van een lage affiniteit staat om een ​​hoge affiniteit toestand bij de cel leading edge is belangrijk voor de T-lymfocyt migratie

Protocol

1. Isolatie van menselijke T-lymfocyten

1. Verkrijgen menselijk bloed van een gezonde donor. Laat het bloed op kamertemperatuur (~ 30 min) afkoelen voordat u verder gaat met de volgende stap.
2. Voorzichtig Pipetteer 3 ml kamertemperatuur Polymorph dichtheidsgradiënt media in een 8 ml ronde bodem polystyreen buis. Voorzichtig Voeg 3 ml bloed op de top van de Polymorph media. Het is belangrijk om te voorkomen dat het mengen van de twee reagentia.
3. Centrifugeer de buizen op 500 xg gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
4. Na het centrifugeren, hebben het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) nu gescheiden van andere bloedcomponenten in de bovenste cellaag. De PBMC laag verschijnt, van boven naar beneden, als de eerste troebel band.
5. Verwijder voorzichtig het heldere geel gekleurde bovenste fase van het bloed, boven de PBMC laag, en gebruik vervolgens een P1000 micropipet aan de PBMC laag over in een 15 ml of 50 ml conische buis.
6. Twee keer Was de PBMC met PBS, centrifugeren cellen op 500 xg gedurende 5 minuten per keer. Het supernatant wordt half bewolkt na elke wasbeurt.

2. Cultuur van de Mens T-lymfocyten

1. Met behulp van een pipet, de PBMC over te dragen aan een T-75 cultuur kolf in 20 ml RPMI 1640 medium met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1 ug / ml fytohemagglutinine (PHA).
2. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO ₂ voor minimaal 1 uur, en tot 24 uur. Deze stap maakt monocyten, die zal worden aanhanger van de kolf oppervlak, worden gescheiden van de lymfocyten die blijven in suspensie. Als een korte incubatie (1 uur) wordt gebruikt bij deze stap, is het acceptabel om RPMI 1640 medium met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine, zonder aan te vullen met PHA zoals gespecificeerd in stap 2.1 gebruikt.
3. Verwijder voorzichtig al het afdrukmateriaal uit de kolf, voeg deze toe aan een 50 ml conische buis, en centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten.
4. Resuspendeer de celpellet, die voornamelijk bevat nu lymfocyten, en de cellen om een ​​nieuwe T-75 kolf met 25 ml RPMI 1640 medium met 10% FBS transfer, 1% penicilline / streptomycine en 1 ug / ml PHA.
5. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 dagen (2 dagen als de eerste incubatie van PBMC 's nachts was). Na 24 uur van de groei, kan het nodig zijn van 15-20 ml vers medium toe te voegen en een grotere T-175 fles overdracht.
6. Na 3 dagen gebruik van een pipet aan de media en opgehangen lymfocyten uit de kolf en over te dragen aan een 50 ml conische buis. Centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten.
7. Resuspendeer de celpellet en overdracht cellen om een ​​nieuwe T-75 of T-175 kolf met 25 ml (T-75) of 50 ml (T-175) RPMI 1640 met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, en 20 ng / ml humaan IL-2 of IL-15.
8. Grow-lymfocyten voor 4-7 dagen. Als beginnend met een T-75 kolf, zal de cultuur moeten worden uitgebreid en overgebracht naar een T-175 fles na 1-2 dagen.

3. In vitro lymfocytenmigratie Assay

1. 1 dag vóór de migratie test, jas een glazen bodem 0,17 mm schotel met 20 ug / ml Proteïne A of G in PBS overnacht bij 4 ° C.
2. Uitgebreid Was de schaal met PBS.
3. Immobiliseren menselijke ICAM-1/Fc (10 ug / ml) en menselijke SDF-1 (2 ug / ml) door het toevoegen van deze reagentia in PBS oplossing voor de schotel en 4 uur incuberen bij kamertemperatuur.
4. Bereid T-lymfocyten door eerst het bepalen van de celdichtheid aan cultuur in de T-175 fles met behulp van een hemacytometer. Ongeveer 2-5 x 10 ⁵ cellen worden gebruikt per schotel naar een celdichtheid geschikt is voor de migratie analyse.
5. Twee keer wassen T-lymfocyten met PBS en vervolgens opnieuw in suspensie in 1 ml L-15 medium met 1 mg / ml D-glucose.
6. Was de schaal bedekt met ICAM-1/Fc en SDF-1 uitgebreid met PBS.
7. Transfer T-lymfocyten in 1 ml media om de schotel en ze op 37 ° C te houden

4. Het vastleggen van een Image Sequence Met behulp van NIS Elements-software

1. Open NIS Elements software.
2. In de camera-instellingen menu, kies "2x2 binning" als de modus voor zowel live beeldvorming en beeld vast te leggen.
3. Ga naar het menu Toepassingen en kies Definieer / Run Experiment.
4. Kies de lengte van de tijd tussen de beelden en de totale lengte van het beeld vast te leggen volgorde.
5. Druk op de "Run" knop om de afbeelding overname te beginnen.
6. Cellen kunnen worden getraceerd en migratie parameters (snelheid, weglengte, verplaatsing, enz.) gekwantificeerd met behulp van een van de verschillende softwarepakketten, waaronder ImageJ, AutoQuant of Volocity (figuur 1).
7. Voor het genereren van een 'spinnenweb plot,' de xy coördinaten voor elke cel en tijdstip bepaald worden verzameld (figuur 2) en geprojecteerd op een grafiek met een gemeenschappelijk uitgangspunt voor elke cel in de oorsprong (figuur 3).

5. Representatieve resultaten

Op dag 6 van cultuur in de aanwezigheid van een IL-2 of IL-15, T-lymfocytenmake-up> 98% van de cellen, zoals bepaald door positieve CD3 kleuring als positieve CD4-en / of CD8 vlekken. Voor IL-2, vonden we 83% CD4 +-cellen, 15% CD8 + en <1% CD4 + CD8 + cellen. Voor IL-15, vonden we 88% CD4 +-cellen, 11% CD8 + en <1% CD4 + CD8 + cellen. Tijdens de T-lymfocyt migratie op ICAM-1/SDF-1 substraten, cellen vertoonden een snelheid van ongeveer 15 micrometer / min die kan worden volgehouden meer dan een 1 uur tijd. T-lymfocyt migratie op ICAM-1/SDF-1 is afhankelijk van LFA-1-gemedieerde adhesie, als een anti-ligand LFA-1-blokkerende antilichaam ernstig remt migratie.

Figuur 1. Cel volgen van het migreren van T-lymfocyten. T-lymfocyten geïsoleerd uit volbloed en gekweekt in de aanwezigheid van IL-2 of IL-15 voor 6 dagen mochten hechten en migreren op glas-bodem schalen bekleed met 10 ug / mL ICAM-1 en 2 ug / ml SDF-1. Beelden werden verworven elke 10 seconden gedurende 30 minuten. De cellen werden geïdentificeerd in elk beeld en gevolgd in de tijd met behulp van Volocity software. Deze film toont de willekeurige migratie van T-lymfocyten met een snelheid van ~ 15 micrometer / min.

Klik hier om de video te zien.
Film 1. Cell volgen van het migreren van T-lymfocyten. T-lymfocyten geïsoleerd uit volbloed en gekweekt in de aanwezigheid van IL-2 of IL-15 voor 6 dagen mochten hechten en migreren op glas-bodem schalen bekleed met 10 ug / mL ICAM-1 en 2 ug / ml SDF-1 . Beelden werden verworven elke 10 seconden gedurende 30 minuten. De cellen werden geïdentificeerd in elk beeld en gevolgd in de tijd met behulp van Volocity software. Deze film toont de willekeurige migratie van T-lymfocyten met een snelheid van ~ 15 micrometer / min.

Figuur 2. Spatio-temporele cel positie. De XY coördinaten van elke cel werden verkregen voor elk tijdstip met behulp van Volocity software.

Figuur 3. "Spider web plot." Met behulp van de XYt coördinaten voor elke cel, 15 cellen werden willekeurig gekozen en uitgezet met een gemeenschappelijke startpunt bij de oorsprong. Het vergelijken van spinnenweb plots geeft een snelle visuele weergave van de verschillen in de migratie tussen de verschillende experimentele condities. Percelen voor de T-lymfocyt migratie onder controle condities (linker paneel) en in de aanwezigheid van een anti-ligand LFA-1-blokkerende antilichaam (rechter paneel).

Discussie

In dit experiment geven we details over een eenvoudig systeem om de beweeglijkheid van de primaire menselijke T-lymfocyten te analyseren. In vitro migratie testen zijn gebruikt om de rol van de vele moleculen en signaalwegen die betrokken zijn bij de motoriek van de verschillende celtypes ontleden. Een aantal kritische controles in gedachten te houden bij het ontwerpen van je eigen experiment uit ons protocol zijn: 1) Niet-klevende en niet-klevende integrine substraat coatings, zoals bovine serum albumine (BSA)...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS