Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: een methode met hoge doorvoer om larvaal gedrag te onderzoeken als reactie op aversieve visuele stimulus

Abstract

Bron: Richendrfer, H., et al. Geautomatiseerde gedragsanalyses met hoge doorvoer in zebravislarven.  J.Vis. Exp. (2013)

De video beschrijft de vermijding en thigmotaxis-test van zebravislarven. De video onderzoekt het gedrag van zebravislarven als reactie op visuele aversieve stimulus.

Protocol

1. Beeld vastleggen

1. In elke rijstrook van de platen kunnen maximaal 20 larven worden geplaatst. Meestal worden 5 larven per baan gebruikt om de meest nauwkeurige tracking van zwemsnelheid te vergemakkelijken en om het aantal larven te verminderen dat per experiment nodig is. De banen kunnen worden gevuld met eiwater met of zonder geneesmiddelen of giftige stoffen, afhankelijk van het experiment. Rijstroken mogen echter niet helemaal worden gevuld totdat ze in de beeldvormingskasten zijn geplaatst; dit voorkomt overloop. Voor consistentie moeten de larven een acclimatisatieperiode van tien minuten hebben nadat ze in de agarose-mallen zijn geplaatst en bovenop het laptopscherm zijn geplaatst. Het efficiënt verplaatsen van de larven van de Petrischaal naar de agarose lane zal helpen om larvenstress te verminderen. Dit is het gemakkelijkst wanneer de larven zijn gehuisvest in ondiepe tanks of petrischalen.
2. De beeldkasten zijn voorzien van een Canon digitale camera die wordt gebruikt voor timelapse fotografie en een laptop. De camera moet aan de bovenkant van de kast worden geplaatst en naar de onderkant van de kast worden gericht, waar een 15,6 inch schermlaptop moet worden geplaatst met het scherm naar boven gericht (figuur 1). Vier platen moeten met de hand direct op het laptopscherm worden geplaatst. Op dit moment kunnen de rijstroken worden aangevuld met eiwater of chemische behandeling, zodat het vlak is met de bovenkant van de baan (om schaduwen aan de randen van de rijstroken in de afbeeldingen te elimineren).
3. Een PowerPoint-presentatie wordt gebruikt als een aversieve stimulus voor de larven. In het verleden werden bewegende rode ballen getoond aan zebravislarven in 6 of 12 multi-well platen. De huidige PowerPoint begint met een lege witte achtergrond gedurende 15 minuten, gevolgd door 15 minuten van een bewegende rode balk op de bovenste helft van de plaat (figuur 2). Om oververhitting van de larven te elimineren, is het het beste om een laptop te kopen met een schermtemperatuur die niet hoger is dan 28 °C. Om verdamping van de vloeistof binnen de agarosebanen te voorkomen, moet de maximale beeldvormingstijd tot minder dan een uur worden gehouden.
4. De digitale camera moet worden geprogrammeerd voor time-lapse fotografie en elke 6 seconden foto's maken voor een totaal van 300 beelden per experiment. De frequentie en lengte kunnen echter worden aangepast afhankelijk van het experiment en de gedragskwantificering. In het verleden werden langere beeldvormingstijden gebruikt met langere intervallen tussen elke afbeelding. De camera kan worden ingesteld op een lagere resolutie voor beeldvorming bij videosnelheid (30 frames per seconde). Hoewel de lagere resolutie de opnamen beperkt tot één multiwell-plaat, zijn de video-opnamen geschikt voor het weergeven van snelle zwemgebeurtenissen.

Results

Figuur 1. Beeldvormende kasten. Beeldvormingskasten zijn speciaal in ons laboratorium gebouwd en gebruikt voor gedragsanalyses met hoge doorvoer. Een 15 megapixel digitale camera werd bevestigd aan de bovenkant van de kast naar beneden om timelapse beelden van de larven te verzamelen in multilane platen geplaatst op het scherm van een laptop. Tussen de platen en het scherm bevindt zich een plastic diffuser die wordt gebru...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging Cabinets 	WoodCraft Towers
Agarose 	Fisher 	BP1356-100
Digital camera	Canon EOS 	Rebel T1i
Laptops 	Acer Aspire 		Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
One well plates	Fisher 	12-565-493
PowerPoint 2010	Microsoft
Plastic diffuser 	Pendaflex	52345