$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Overdracht van kleine molecuulbibliotheek
Hoewel samengestelde overdracht kan worden geautomatiseerd met robotoverdrachtsmethoden, zullen we de handmatige overdrachtsmethode beschrijven.
- Kleine molecuulbibliotheken worden meestal geleverd in een 96-well formaat, waarbij elke verbinding wordt opgeslagen in DMSO als een voorraad van 10 mM. Ongeveer 60 minuten voordat de embryo's het stadium bereiken waarop de verbindingen moeten worden toegevoegd, ontdooit u een gewenst aantal 96-putplaten met aliquots van kleine moleculen (bronplaat). Let op het serienummer of ander identificatienummer van de bronplaten. Om condensatie op de platen te minimaliseren, kan ontdooien optreden in een uitdrogingskamer met Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
- Draai de platen kort naar beneden in een tafelbladcentrifuge uitgerust met een multi-well plaatadapter.
- Verwijder de aluminium afdichtingstape van de bronplaat. Verdun met behulp van een 12-kanaals pipet de verbindingen in de bronplaat tot de concentratie van 0,5 mM (als u bijvoorbeeld begint met 250 nL aliquots van 10 ml bouillon, voegt u 4,75 μL DMSO toe aan elke put).
- Wanneer de embryo's in de 96-putplaat (ontvangerplaat) het gewenste stadium bereiken, gebruikt u een 12-kanaals pipet (2-20 μL) om 2,5 μL verbindingen (0,5 mM) van de bronplaten over te brengen naar de ontvangende platen die de embryo's bevatten.
- Noteer het identificatienummer van de bronplaten op de embryoplaten van de ontvanger. Bedek de ontvangende platen die nu de embryo's en verbindingen bevatten met deksels, meng de platen voorzichtig door zachtjes te wervelen en plaats ze in een incubator van 28,5 °C.
- Bedek elke bronplaat met ongebruikte kleine moleculen (0,5 mM) met een aluminium afdichtingstape en plaats deze in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.
2. Screening op effecten van kleine moleculen door visuele inspectie van fenotypen
- Formuleer voorafgaand aan het uitvoeren van het scherm een specifiek criterium voor wat een "hit" zou zijn.
- Verwijder op de gewenste momenten in ontwikkeling de 96-putplaten met met verbindingen behandelde embryo's uit de incubator en onderzoek elke put onder een stereomicroscoop. Voor een betere visualisatie van subtiele veranderingen, zoals veranderingen in het bloedsomlooppatroon, kan een fasecontrast omgekeerde microscoop worden gebruikt. Fluorescerende microscopie kan worden gebruikt om verstoring van de expressie van GFP- of DsRed-eiwitten onder een weefselspecifieke promotor te onderzoeken.
- Scan snel de 96-putplaten op een put waarin ten minste 3 van de 5 embryo's het voorgeschreven "hit" fenotype vertonen. Noteer de identiteit van de plaat en de putlocatie van elke potentiële treffer.
- Bevestig een potentiële hit opnieuw door de effecten van de verbinding opnieuw te testen in verschillende doses (1 uM, 5 uM, 10 μM en 50 μM). Voor elke dosis worden 10 embryo's getest in 0,5 ml E3-media in een plaatformaat van 48 wells. De timing van de toevoeging van verbindingen voor hertesten moet identiek zijn aan die van de oorspronkelijke screening. Een treffer wordt bevestigd wanneer het uitgelokte fenotype wordt gereproduceerd bij hertesten van de verbinding
- Identificeer de hitverbinding uit de database van kleine moleculen in de chemische bibliotheek.