1. Embryo's genereren door natuurlijke paring
<ol><li>Kweekembryo's tot 3 maanden oud, reproductieve rijpheid.</li>
	<li>Scheid volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenste stam in verdeelde paringstanks op de avond voor het verzamelen van embryo's en voeg 2 mannetjes en 3 vrouwtjes toe aan elke tank. OPMERKING: Het gebruik van de transgene insulin2a:mCherry fluorescerende reporter stam maakte de analyse van pancreas β-cellen mogelijk.</li>
	<li>Breng vis over naar de paringstank met vers systeemwater en verwijder de scheidingswand onmiddellijk nadat de lichten de volgende ochtend branden.</li>
	<li>Laat de vis op natuurlijke wijze paren totdat embryo's in de bodemtank worden waargenomen. Verzamel embryo's in intervallen van 30 minuten totdat de gewenste hoeveelheid is verzameld. Bewaar elk verzameld tijdstip in afzonderlijke petrischalen in embryomedia bij 28,5 °C.</li>
	<li>Micro-injection van genetisch materiaal of plaatsing in experimentele kweekmedia, indien gewenst, en kweek de embryo's in verse Hank's embryo medium in 10-cm Petrischaaltjes bij 28,5 °C. OPMERKING: Voor genexpressieanalyse bij geïnjecteerde of gemuteerde dieren met morfolino (MO) moet worden opgemerkt dat elke manipulatie incidentele effecten kan hebben op de genexpressie. Mutanten kunnen genetische compensatie vertonen op het niveau van transcriptie dat niet wordt waargenomen door MO-gebaseerde gentargeting.</li>
</ol>2. Stadium embryo's
<ol><li>Kweek de embryo's in groepen van 50-75 embryo's per petrischaal van 10 cm om een consistente ontwikkeling van alle embryo's te bevorderen.</li>
	<li>Bewaak de ontwikkelingsmorfologie met behulp van een ontleedmicroscoop in blastomere-, epiboly- en somietstadia om de ontwikkelingsprogressie te garanderen. OPMERKING: Verwijder stervende of misvormde embryo's om ontwikkelingsachterstand in de schaal te voorkomen.</li>
	<li>Scheid de embryo's op basis van de ontwikkelingsleeftijd. Breng de embryo's en larven in scène met een totale lichaamslengte na 24 hpf. OPMERKING: De somieten zijn het chevronvormige mesodermale weefsel dat aanwezig is op het dorsale deel van het embryo.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC&amp;nbsp;</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set&amp;nbsp;</td><td>Aquaneering&amp;nbsp;</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paring en ei-enscenering: een methode om embryo's te genereren en ze te sorteren op ontwikkelingsfase

Bron: Hostelley T.L., et al. <a href="https://www.jove.com/v/56187/" target="_blank">Monstervoorbereiding en -analyse van op RNASeq gebaseerde genexpressiegegevens van zebravissen</a>. J.Vis. Exp. (2017)
Het artikel beschrijft een protocol om zebravisembryo's te genereren door natuurlijke paring en het sorteren van hun ontwikkelingsstadia. Het protocol wordt verder gebruikt voor de analyse van pancreas β-cellen met behulp van transgene vissen.

Paring en ei-enscenering: een methode om embryo's te genereren en ze te sorteren op ontwikkelingsfase

Source: Hostelley T.L., et al. Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)
The article ...

- Start with a mating tank, a tank with a removable insert that allows eggs to fall through. Add two male and three female adult fish to a divided mating tank in the evening before embryo collection to acclimate to each other overnight.
The next morning, transfer the fish into a new mating tank containing system water and remove the divider. Wait for 15 to 30 minutes to give the fish time to mate and spawn.
Now collect the embryos and store them in a Petri dish containing Hank&#39;s embryo medium. Grow them at 28.5 degrees Celsius throughout the protocol. Examine embryos&#39; morphology under a dissecting microscope.
You will observe several developmental features. Cleavage of the blastodisc gives rise to multiple cells. The blastoderm takes the shape of an inverted cup above the yolk cell. Paraxial mesoderm segments develop on the dorsal part of the embryo and so on.
Beyond 24 hours post-fertilization, simply sort embryos by total body length. In the example protocol, we will set up mating of transgenic mCherry reporter fish and sort the resulting embryos.
- To begin, culture embryos to three months of age, which is reproductive maturity. Segregate two adult male and three female fish from the desired strain into divided mating tanks of fresh system water on the evening before embryo collection. The following morning after the lights come on, remove the divider and allow the fish to mate naturally until embryos are observed in the bottom of the tank.
Collect embryos in 30-minute intervals and separate Petri dishes of embryo medium until the desired number are collected. To stage the embryos, culture them in groups of 50 to 75 per 10-centimeter Petri dish to promote consistent developmental timing of all embryos. Then keep the plates at 28.5 degrees Celsius.
Measure the embryo age using somite number after segmentation until approximately 24 hours post fertilization, or HPF, and separate the embryos based on developmental age.

mating-egg-staging-method-to-generate-embryos-sort-them-developmental

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biology

Danio rerio (zebrafish)

Embryo

Mating and Egg Staging: A Method to Generate Embryos and Sort Them by Developmental Stage

2.5K Views. - Start with a mating tank, a tank with a removable insert that allows eggs to fall through. 

Abstract

Protocol

<table><tbody><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC&nbsp;</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set&nbsp;</td><td>Aquaneering&nbsp;</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Paring en ei-enscenering: een methode om embryo's te genereren en ze te sorteren op ontwikkelingsfase

In This Article

Abstract

Protocol

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Name	Company	Catalog Number
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss