Paring en ei-enscenering: een methode om embryo's te genereren en ze te sorteren op ontwikkelingsfase

Abstract

Bron: Hostelley T.L., et al. Monstervoorbereiding en -analyse van op RNASeq gebaseerde genexpressiegegevens van zebravissen. J.Vis. Exp. (2017)

Het artikel beschrijft een protocol om zebravisembryo's te genereren door natuurlijke paring en het sorteren van hun ontwikkelingsstadia. Het protocol wordt verder gebruikt voor de analyse van pancreas β-cellen met behulp van transgene vissen.

Protocol

1. Embryo's genereren door natuurlijke paring

1. Kweekembryo's tot 3 maanden oud, reproductieve rijpheid.
2. Scheid volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenste stam in verdeelde paringstanks op de avond voor het verzamelen van embryo's en voeg 2 mannetjes en 3 vrouwtjes toe aan elke tank.
   OPMERKING: Het gebruik van de transgene insulin2a:mCherry fluorescerende reporter stam maakte de analyse van pancreas β-cellen mogelijk.
3. Breng vis over naar de paringstank met vers systeemwater en verwijder de scheidingswand onmiddellijk nadat de lichten de volgende ochtend branden.
4. Laat de vis op natuurlijke wijze paren totdat embryo's in de bodemtank worden waargenomen. Verzamel embryo's in intervallen van 30 minuten totdat de gewenste hoeveelheid is verzameld. Bewaar elk verzameld tijdstip in afzonderlijke petrischalen in embryomedia bij 28,5 °C.
5. Micro-injection van genetisch materiaal of plaatsing in experimentele kweekmedia, indien gewenst, en kweek de embryo's in verse Hank's embryo medium in 10-cm Petrischaaltjes bij 28,5 °C.
   OPMERKING: Voor genexpressieanalyse bij geïnjecteerde of gemuteerde dieren met morfolino (MO) moet worden opgemerkt dat elke manipulatie incidentele effecten kan hebben op de genexpressie. Mutanten kunnen genetische compensatie vertonen op het niveau van transcriptie dat niet wordt waargenomen door MO-gebaseerde gentargeting.

2. Stadium embryo's

1. Kweek de embryo's in groepen van 50-75 embryo's per petrischaal van 10 cm om een consistente ontwikkeling van alle embryo's te bevorderen.
2. Bewaak de ontwikkelingsmorfologie met behulp van een ontleedmicroscoop in blastomere-, epiboly- en somietstadia om de ontwikkelingsprogressie te garanderen.
   OPMERKING: Verwijder stervende of misvormde embryo's om ontwikkelingsachterstand in de schaal te voorkomen.
3. Scheid de embryo's op basis van de ontwikkelingsleeftijd. Breng de embryo's en larven in scène met een totale lichaamslengte na 24 hpf.
   OPMERKING: De somieten zijn het chevronvormige mesodermale weefsel dat aanwezig is op het dorsale deel van het embryo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss